4.甲基化分析
为了确定糖苷残基的连接模式，对多糖进行了甲基化分析。原始多糖（L01-B1）、降解多糖（L01-B102-I）和还原多糖的甲基化分析结果见表2和图S5，L01-B1和RL01-B1中PMAAs的气相色谱-质谱联用（GC‒MS）谱图见图S6。根据甲基化数据和单糖组成分析结果的结合，L01-B1的主要连接模式如下：1,4-GalpA（11.1%）、1,2-Rhap（5.57%）、1,2,4-Rhap（9.56%）、T-Galp（9.37%）、1,4-Galp（14%）、1,3,6-Galp（6.67%）、1,6-Galp（4.24%）、1,3-Galp（3.22%）、T-Araf（8.83%）、1,5-Araf（21.07%）、1,3,5-Araf（4.97%）和T-GlcpA（1.4%）。与原始多糖的甲基化数据相比，L01-B1中未检测到T-Glcp，而在还原多糖RL01-B1中检测到1.4%的T-Glcp。这一发现表明，原始多糖中的葡萄糖醛酸残基以T-GlcpA的形式存在。此外，比较原始多糖和还原产物的甲基化数据，发现还原产物中1,4-Galp的含量显著增加，表明原始多糖中的半乳糖醛酸残基以1,4-GalpA的形式存在。
与L01-B1相比，L01-B102-I中鼠李糖和半乳糖醛酸的比例增加，同时1,6-Galp的含量增加，而1,4-Galp、1,3,6-Galp和1,3-Galp的含量减少。这些数据表明，主链包含1,6-Galp，并且在C-3位有一些1,6-Galp分支。通过核磁共振（NMR）进一步分析了具体的分支结构。观察到1,2-Rhap的增加和1,2,4-Rhap的减少表明分支连接在1,2-Rhap的C-4位。部分酸水解切断了这些分支，导致1,2-Rhap含量的增加。
这些发现表明，该多糖的主链由1,4-GalpA、1,2-Rhap（或1,2,4-Rhap）和1,6-Galp组成。
5.核磁共振（NMR）分析
通过整合单糖组成、甲基化分析和部分酸水解的结果，对L01-B1及其降解产物L01-B102-I的一维NMR谱图（图2）和二维NMR谱图（图3）进行了分析，并完成了信号归属。
在L01-B1的¹H NMR谱图（图2a）中，异头质子区域的信号分别为：5.30 ppm（T-α-Araf(A)的H-1）、5.22 ppm（1,3,5-α-Araf(C)的H-1）、5.16 ppm（1,5-α-Araf(B)的H-1）、4.70 ppm（T-β-Galp(D)的H-1）、4.55 ppm（1,3,6-β-Galp(F)的H-1）和4.71 ppm（1,4-β-Galp(H)的H-1）。1,3-β-Galp(E)和1,6-β-Galp(G)的H-1信号峰在4.59 ppm处重叠。此外，1,2-α-Rhap(J)和1,2,4-α-Rhap(K)的H-1信号峰在5.30 ppm处重叠。5.08 ppm和4.69 ppm处的信号分别归属于1,4-α-GalpA(I)和T-β-GlcpA(L)的H-1。1.32 ppm和1.37 ppm处的信号分别归属于1,2-α-Rhap(J)和1,2,4-α-Rhap(K)的甲基碳的H信号。
在L01-B102-I的¹H NMR谱图（图2b）中，异头质子区域的信号分别为：4.68 ppm（1,3-β-Galp(e)的H-1）、4.54 ppm（1,3,6-β-Galp(f)的H-1）和4.69 ppm（1,4-β-Galp(h)的H-1）。T-β-Galp(d)和1,6-β-Galp(g)的H-1信号峰在4.51 ppm处重叠，而1,2-α-Rhap(j)和1,2,4-α-Rhap(k)的H-1信号峰在5.28 ppm处重叠。5.10 ppm和4.66 ppm处的信号分别归属于1,4-α-GalpA(i)和T-β-GlcpA(l)的H-1。
在L01-B1的¹³C NMR谱图（图2c,图S7a）中，异头碳区域的信号分别为：110.54 ppm（T-α-Araf(A)的C-1）、108.75 ppm（1,5-α-Araf(B)的C-1）、108.34 ppm（1,3,5-α-Araf(C)的C-1）、104.62 ppm（T-β-Galp(D)的C-1）、103.99 ppm（1,3-β-Galp(E)的C-1）和105.59 ppm（1,4-β-Galp(H)的C-1）。1,3,6-β-Galp(F)和1,6-β-Galp(G)的C-1信号峰在104.84 ppm处重叠。1,2-α-Rhap(J)和1,2,4-α-Rhap(K)的C-1信号峰在99.96 ppm处重叠。1,4-α-GalpA(I)的C-1信号为98.84 ppm。T-β-GlcpA(L)的C-1信号较弱，为102.65 ppm。1,4-α-GalpA(I)和T-β-GlcpA(L)的羧基碳信号分别为175.29 ppm和174.62 ppm。1,2-α-Rhap(J)和1,2,4-α-Rhap(K)的甲基碳信号分别为17.84 ppm和18.09 ppm。
在L01-B102-I的¹³C NMR谱图（图2d,图S7b）中，异头碳区域的信号分别为：104.94 ppm（T-β-Galp(d)的C-1）、104.20 ppm（1,3-β-Galp(e)的C-1）和105.60 ppm（1,4-β-Galp(h)的C-1）。1,3,6-β-Galp(f)和1,6-β-Galp(g)的C-1信号峰在104.68 ppm处重叠。1,2-α-Rhap(j)和1,2,4-α-Rhap(k)的C-1信号峰在100.32 ppm处重叠。1,4-α-GalpA(i)的C-1信号为98.99 ppm。T-β-GlcpA(l)的C-1信号较弱，为102.66 ppm。
在L01-B1的DEPT 135°谱图（图S7c）中，68.10 ppm、68.09 ppm和62.30 ppm处的倒置峰分别归属于1,3,5-α-Araf(C)、1,5-α-Araf(B)和T-α-Araf(A)的C-5。62.14 ppm、61.79 ppm和61.95 ppm处的倒置峰分别归属于T-β-Galp(D)、1,3-β-Galp(E)和1,4-β-Galp(H)的C-6。1,6-β-Galp(G)和1,3,6-β-Galp(F)的C-6信号峰在70.53 ppm处重叠。其他信号归属基于HSQC谱图（图3a）和COSY谱图（图S8a）详细列出在表3中。在L01-B102-I的DEPT 135°谱图（图S7d）中，62.24 ppm、61.96 ppm和62.24 ppm处的倒置峰分别归属于T-β-Galp(d)、1,3-β-Galp(e)和1,4-β-Galp(h)的C-6。1,6-β-Galp(g)和1,3,6-β-Galp(f)的C-6信号峰在70.74 ppm处重叠。其他信号归属基于HSQC谱图（图3b）和COSY谱图（图S8b）详细列出在表4中。
图2.（a）L01-B1的¹H NMR谱图。（b）L01-B102-I的¹H NMR谱图。（c）L01-B1的¹³C NMR谱图。（d）L01-B102-I的¹³C NMR谱图。（a）和（b）展示了L01-B1中各种糖苷键对应的异头质子的化学位移，而（c）和（d）则显示了异头碳和与1,6-β-Galp残基相关的C-6特征共振信号。
图3.（a）L01-B1的二维NMR谱图。（b）L01-B102-I的二维NMR谱图。叠加了HSQC（红色）和HMBC（黑色）谱图。（A:T-α-Araf;B:1,5-α-Araf;C:1,3,5-α-Araf;D/d:T-β-Galp;E/e:1,3-β-Galp;F/f:1,3,6-β-Galp;G/g:1,6-β-Galp;H/h:1,4-β-Galp;I/i:1,4-α-GalpA;J/j:1,2-α-Rhap;K/k:1,2,4-α-Rhap;L/l:T-β-GlcpA）
通过L01-B1的HMBC谱图（图3a），可以确定糖苷键之间的顺序连接性。δ105.59/4.23和δ81.41/4.71处的交叉峰表明，1,4-β-Galp(H)的C-1与1,4-β-Galp(H)的H-4相关联，且1,4-β-Galp(H)的C-4与1,4-β-Galp(H)的H-1相关联，表明存在连续的1,4-β-Galp结构。
δ105.59/3.78处的交叉峰表明，1,4-β-Galp残基连接到1,2,4-α-Rhap的C-4。此外，δ103.99/3.71处的交叉峰表明，1,3-β-Galp(E)的C-1与1,3,6-β-Galp(F)的H-3相关联，表明1,3-Galp残基连接到1,3,6-β-Galp的C-3。δ81.46/4.70处的交叉峰表明，T-β-Galp残基连接到1,3,6-β-Galp的C-3。δ83.65/5.30处的交叉峰表明，1,3-β-Galp(E)的C-3与T-α-Araf(A)的H-1相关联，表明T-α-Araf残基连接到1,3-β-Galp。δ108.75/3.84和δ68.09/5.16处的交叉峰表明，1,5-α-Araf(B)的C-1与1,5-α-Araf(B)的H-5相关联，且1,5-α-Araf(B)的C-5与1,5-α-Araf(B)的H-1相关联，表明存在连续的1,5-α-Araf残基链。δ68.10/5.30处的交叉峰表明，1,3,5-α-Araf(C)的C-5与T-α-Araf(A)的H-1相关联，表明T-α-Araf残基连接到1,3,5-α-Araf。δ85.17/5.30处的交叉峰表明，1,3,5-α-Araf(C)的C-3与T-α-Araf(A)的H-1相关联。δ108.75/4.02处的交叉峰表明，1,5-α-Araf残基连接到1,3,5-α-Araf的C-3。δ77.56/5.16处的交叉峰表明，1,5-α-Araf(B)的H-1与1,2,4-α-Rhap(K)的C-4相关联，表明1,5-α-Araf残基连接到1,2,4-α-Rhap的C-4。此外，δ108.75/3.85处的交叉峰表明，1,5-α-Araf(B)的C-1与1,3,5-α-Araf(C)的H-5相关联，表明1,5-α-Araf残基连接到1,3,5-α-Araf的C-5。最后，δ77.56/4.69处的交叉峰表明，T-β-GlcpA(L)的H-1与1,2,4-Rhap(K)的C-4相关联。
在L01-B102-I的HMBC谱图（图3b）中，δ98.99/4.20处的交叉峰表明，1,4-α-GalpA(i)的C-1与1,2,4-α-Rhap(k)的H-2相关联，δ77.80/5.10处的交叉峰表明，1,2,4-α-Rhap(k)的C-2与1,4-α-GalpA(i)的H-1相关联，δ100.32/4.52处的交叉峰表明，1,2,4-α-Rhap(k)（或1,2-α-Rhap(j)）的C-1与1,4-α-GalpA(i)的H-4相关联，δ78.53/5.28处的交叉峰表明，1,4-α-GalpA(i)的C-4与1,2,4-α-Rhap(k)（或1,2-α-Rhap(j)）的H-1相关联。
综合这些糖苷相关性，表明1,2-α-Rhap和1,4-α-GalpA可能交替构成L01-B1的主链，并且侧链连接到1,2,4-α-Rhap残基的C-4。此外，δ70.74/5.28处的交叉峰表明，1,3,6-β-Galp(f)的C-6与1,2,4-α-Rhap(k)（或1,2-α-Rhap(j)）的H-1相关联，表明在主链的果胶结构域上，1,2,4-α-Rhap（或1,2-α-Rhap）连接到1,6-β-Galp的C-6。δ104.68/4.10和δ70.74/4.54处的交叉峰表明，1,6-β-Galp(g)（或1,3,6-β-Galp(f)）的C-1与1,6-β-Galp(g)的H-6相关联，且1,6-β-Galp(g)的C-6与1,3,6-β-Galp(f)的H-1相关联，表明主链上存在连续的1,6-β-Galp残基，并且在1,3,6-Galp的C-3处有分支。
为了进一步阐明侧链结构，对L01-B102-O进行了ESI‒MS分析，结果见图S9。综合上述数据，以及单糖组成分析结果、甲基化分析结果和多糖的分子量，得出了L01-B1的可能结构，见图4。
图4.L01-B1的可能结构。Galp:半乳糖；GalpA:半乳糖醛酸；Rhap:鼠李糖；Araf:阿拉伯糖；GlcpA:葡萄糖醛酸。
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