摘要：采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子，PCR初步确诊为猫杯状病毒（FCV）和猫疱疹病毒（FHV-1）混合感染。利用猫肾细胞（CRFK）对样本进行病毒分离，前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性，第三代开始只有FCV阳性，由此分离出FCV。制备此株FCV的鼠源多克隆抗体，并中和混合培养物中的FCV，从而分离出FHV-1，命名为HRB2019株。通过病毒粒子形态观察、间接免疫荧光试验（IFA）和基因序列分析等方法鉴定HRB2019株，并研究其体外生长动力学。结果显示，HRB2019株可在CRFK细胞上产生典型病变，测得其第四代病毒滴度为1×108.43TCID50·mL-1；电镜下可观察到球形、有囊膜、直径约为200 nm的病毒粒子；IFA结果显示，分离株可与FHV-1阳性血清结合，出现特异性荧光；扩增分离株的gD基因，其与国内外流行株高度同源。病毒一步生长曲线表明，HRB2019株感染细胞12 h后开始复制增殖，12~36 h为快速增殖期，48~72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰，84 h病毒滴度开始下降。本研究首次从FCV与FHV-1混合感染的病料中成功分离出FHV-1，为FHV-1的流行病学调查和病原学研究提供了重要数据，为混合感染中生长弱势毒株的分离提供了方法学依据。
猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus type-1,FHV-1)和猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)是引发猫上呼吸道感染的主要病原。FHV-1属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科成员，是有囊膜的双股DNA病毒，只有一个血清型。FHV-1引起的猫科动物上呼吸道急性高度接触性传染病也被称作猫传染性鼻气管炎，该病发病率极高，成年猫和幼猫均易感，尤其是幼猫，感染后可引起死亡。临床上以喷嚏、角膜结膜炎、嗜睡及精神沉郁等为主要特征。FCV为杯状病毒科，水疱疹病毒属成员。FCV在猫群中广泛分布，多感染幼龄猫，感染后引起的临床症状为口腔溃疡、急性呼吸道疾病、鼻炎、跛行、肺炎等。由于FHV-1、FCV感染引起的临床症状相似，故很难通过临床诊断确诊，通常需要实验室分子生物学方法进行鉴别诊断。
同时,FHV-1常与FCV混合感染，因两种病毒增殖速度差异巨大，给病原的分离鉴定带来极大的困难。本研究曾尝试多种方法从FHV-1和FCV混合感染的临床病料中分离两种病毒均以失败告终后，最终采用血清中和方法成功分离出FHV-1，并对其生物学特性进行鉴定。目前国内外尚未见从FHV-1和FCV混合感染的临床病料中分离两种病毒的报道，因此本研究为FHV-1流行株的分离、鉴定提供了有效方案，丰富了FHV-1的流行病学及病原学数据，为猫上呼吸道疾病的诊断、治疗和防控提供必要的技术支撑。
1材料与方法
1.1病料与细胞
眼、鼻拭子取自哈尔滨某猫舍患上呼吸道感染的病猫，临床表现为喷嚏、食欲不振、眼鼻分泌物多、严重结膜炎；猫肾细胞(CRFK)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自然疫源性人兽共患病创新团队保存；昆明鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。
1.2主要试剂和仪器
病毒核酸(DNA/RNA)提取试剂盒购自AXYGEN公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司；1640培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%Trypsin-EDTA购自Gibco公司；2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)购自Vazyme公司；DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司；NaRedⅡ核酸染料购自北京派拓科技有限公司；QuickAntibody-Mouse5 W佐剂购自北京博奥龙免疫技术有限公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司；FITC标记的山羊抗猫IgG购自Jackson ImmunoResearch公司；胶回收试剂盒购自Omega生物公司；FHV-1 HR-1株及其猫源阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自然疫源性人兽共患病创新团队保存；PCR仪购自博日科技有限公司；DYY-6D电泳仪电源购自北京六一生物科技有限公司；倒置荧光显微镜购自Nikon公司。
1.3病料PCR/RT-PCR检测
利用AxyPrep病毒核酸提取试剂盒提取病料拭子核酸，分别用FHV-1、FCV、猫衣原体(chlamydophila felis,C felis)的特异性鉴定引物进行检测，引物序列见表1，由库美生物科技有限公司合成。FCV的反转录体系及程序参照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书。FHV-1、FCV和C felis的PCR扩增体系为：2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)10μL，ddH2O 6μL，上、下游引物各1μL，模板2μL，共20μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共32个循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
表1引物序列信息
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