1.3.2随机扩增多片段DNA（RAPD）试验
待测菌液在4℃下12 000g离心5 min，收集菌体用无菌水重悬，加入玻璃珠，95℃加热5 min，涡旋震荡5 min，离心后保留上清为DNA模板，-20℃备用。每20μL PCR反应体系：2×Master Mix 10μL，ddH2O 5μL、随机引物S23 1μL，4μL DNA模板。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶分析。
1.3.3产蛋白酶乳杆菌的16S rDNA鉴定
DNA模板制备方法同上。16S rDNA扩增反应体系50μL：ddH2O 15μL；2×Taq Plus PCR MasterMix 25μL；上游引物27F 1μL；下游引物1492R 1μL；DNA模板8μL。电泳分析检测菌株单一性，挑选1 500 bp条带的进行序列分析，利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的BLAST工具分析比对序列。
1.3.4菌株生长曲线的测定
将活化菌株按1%的接种量接种至生长曲线测定板中，加入200μL MRS培养基。在Bioscreen C生长曲线测定仪中连续培养48 h，每隔30 min测定吸光度值（OD 600 nm），并绘制出生长曲线图。
1.3.5胃酸耐受能力测定
参照李尧等方法，将活化好的菌株离心后用无菌PBS洗涤2次，离心弃上清后分别用pH 2.5的MRS液体培养基重悬。取1 mL pH 2.5的MRS菌体重悬液置于9 mL pH 2.5的MRS液体培养基中，37℃恒温培养0、0.5 h和3.0 h后平板计数，计算菌存活率（%）。
1.3.6胆盐耐受能力测定
胆盐耐受能力测定参考LEBEER等方法稍作修改，将上述洗涤后菌悬液加入到等体积0.2%猪胆盐培养液中，37℃培养0、0.5、3.0 h后平板计数，计算菌存活率（%）。
1.3.7产胞外多糖能力测定
利用苯酚硫酸法测定发酵液中胞外多糖含量。
1.3.8表面疏水性能力测定
将1 mL二甲苯加入3 mL菌悬液中，震荡旋转120 s，37℃培养箱静止120 min，分离有机相和水相。去除有机相，以PBS为对照，在600 nm处测定水相的吸光度。疏水性百分比计算方法如下。
疏水性（%）=（A0-At）/A0×100%
式中：A0为初始时OD 600 nm值；At为反应后OD 600 nm值。
1.3.9自聚集能力测定
将4 mL菌悬液震荡旋转120 s，在室温（37℃培养箱）下孵育5 h，取1 mL上层清液，测定OD 600 nm吸光度。自聚集百分比计算方法如下。
自聚集（%）=（1-At/A0）×100%
式中：A0为初始时OD 600 nm值；At为静止后OD 600 nm值。
1.4数据分析
所有试验均独立进行3次，结果由平均值±标准差（X±SD）表示。使用SPSS软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）中沃勒-邓肯方法进行显著性分析，P＜0.05为有统计学差异。使用Origin 2021 Pro绘图。
2结果与分析
2.1婴儿粪便中乳杆菌的初步分离筛选
在黑龙江省共采集到16份不同婴儿粪便样品，部分乳杆菌的光学显微镜形态见图1。显微镜下观察到菌体形态包括长杆、短杆、弯曲杆及链状。
图1部分乳杆菌形态
2.2产蛋白酶乳杆菌的筛选
蛋白水解度实际上反映的是氨基酸利用与释放之间的动态平衡，指标并不能直接反映菌株的蛋白酶活性。本试验采用蛋白质水解度结合脱脂乳平板法观察透明圈直径共同考察各菌株产蛋白酶情况。
2.2.1蛋白圈直径和蛋白质水解度分析
将分离纯化得到的169株乳杆菌接种至12%灭菌脱脂乳发酵，凝乳结实的共72株，将72株乳杆菌放置脱脂乳固体平板中，以未接种并培养24 h后的脱脂乳样品为对照，观察其产生透明圈，并测定这些菌株的蛋白水解度。
乳杆菌生长于脱脂乳培养基中时能分解乳中蛋白质生成游离氨基酸，不同菌株生成游离氨基酸的能力不同。由图2可见，11株菌株均产生较为明显的透明圈，透明圈直径最大的是菌株T91和T95，均超过19 mm，但它们之间无统计学差异（P>0.05）。蛋白质水解度分析结果表明菌株T95的蛋白水解度在所有菌株中最高，可达到18.61±0.38 mmol/L，且显著高于其他菌株（P＜0.05），其次是菌株N35、N38、T91和S29。所有试验菌株的蛋白水解能力均高于对照菌株LGG和LP_6110。本试验测定结果略高于张爽等测定69株菌株L-Leu的蛋白水解度，其测定范围在1.89±0.14 mmol/L~11.60±0.52 mmol/L。
图2产蛋白酶菌株蛋白水解度和水解圈直径
2.2.2 RAPD图谱
RAPD技术已经在微生物基因型识别领域得到广泛运用。为避免筛选出的菌株为同一菌株，以LGG和LP_6110作为对照，采用S23引物对上述试验得到的11株菌进行PCR扩增，剔除条带和来源相同的菌株，最终挑选出8株性状各不相同的乳杆菌，得到RAPD图谱见图3。由图3可见，不同菌株之间的电泳图有差异，菌株S21和P59比较相似，但来源于不同样品，在光学显微镜下菌体形态差异较大，因此也将2株菌进行了保留。
图3 8株产蛋白酶菌株RAPD电泳
2.2.3菌株16S rDNA序列同源性分析
将得到的8株菌进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，电泳条带明亮清晰且分子质量皆在1 500 bp左右，符合测序要求。将扩增产物进行测序并拼接，在NCBI数据库中进行比对（http://www.ncbi.nlm.nin.gov/BLAST）。序列比对结果见表1。所有菌均为鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）。
表1 NCBI BLAST比对结果
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