研究简介
抗生素抗性进化是全球公共卫生的重大威胁之一，下一代测序表明，适应抗生素的细菌种群通常包含具有不同耐药性决定因素的多个克隆。尽管它们在主要选择性条件下的适应性可能相当，但这些替代方案在其他相关条件下可能表现出不同的负债和优势。本研究通过定向进化实验，探讨了碳青霉烯酶Klebsiella pneumoniae carbapenemase-2（KPC-2）在适应性进化过程中如何迅速积累隐秘的表型变异。研究者利用定向进化方法，研究了KPC-2在适应性进化过程中对CAZ的抗性进化路径多样性。研究人员将野生型blaKPC-2基因克隆到高拷贝质粒中，并通过易错PCR创建了约10³至10⁴个突变体库。通过在不同浓度的CAZ中筛选，研究者选择了具有CAZ抗性的突变体，并对其进行了多轮突变和筛选。通过Sanger测序确定了突变体的基因型，并通过最小抑制浓度（MIC）测试评估了其表型。此外研究者还测量了酶的催化效率、细胞内稳定性和生长速率等分子性状。研究发现KPC-2可以通过多种不同的突变路径进化出对头孢他啶（ceftazidime,CAZ）的高活性，这些路径在分子水平（如催化效率和细胞内稳定性）和宏观水平（如生长速率和其他β-内酰胺类抗生素的活性）上表现出显著差异。尽管这些突变路径在最终的CAZ抗性上表现出相似性，但在其他性状上的差异表明，即使在强选择压力下，进化路径和结果也可能因初始突变的不同而迅速分化。这些发现对于理解抗生素抗性进化的复杂性以及设计有效的抗性管理策略具有重要意义。
Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C Pro生长曲线分析仪被用于测量KPC-2及其突变体在不同条件下的生长速率。研究人员将E.coli TOP10菌株（表达KPC-2及其突变体）接种到含有8µg/ml CAZ或50µg/ml卡那霉素的LB肉汤中，使用Bioscreen生长曲线分析仪在37°C下培养20小时。每隔10分钟测量一次600 nm处的吸光度（OD600），以评估菌株的生长情况。通过生长曲线分析，研究者能够确定不同突变体在CAZ存在和不存在条件下的生长速率差异。这些数据对于理解突变体在不同环境下的适应性具有重要意义，尤其是在评估抗生素抗性进化过程中潜在的适应性成本方面。
实验结果
研究发现KPC-2可以通过至少四种不同的初始突变进化出对CAZ的高活性，这些突变在不同路径中表现出显著的表型差异。尽管在CAZ抗性上表现出相似性，但在其他性状上（如催化效率、细胞内稳定性和生长速率）表现出显著差异。此外，研究还发现，即使在CAZ MICs稳定后，突变路径仍在继续进化，表现为细胞内稳定性和生长速率的进一步优化。本研究揭示了KPC-2在适应性进化过程中对CAZ的抗性进化路径多样性。研究结果表明，即使在强选择压力下，进化路径和结果也可能因初始突变的不同而迅速分化。这些发现对于理解抗生素抗性进化的复杂性以及设计有效的抗性管理策略具有重要意义。
图1、KPC-2定向进化过程中恢复的突变途径，以增加CAZ耐药性。a，在第1轮分离的最初22个菌落中检索到的9个独特KPC-2变体的丰度。根据先前显示与CAZ抗性相关的四个位置之一的氨基酸取代位置，它们被分为四类（如颜色差异所示）。加号表示编码KPC-2的基因中存在其他辅助突变（补充表1）。较深的阴影表示重复的总丰度，而较浅的阴影表示独立的出现。b，跨轮次同义突变的比例（带圆圈的黑实线;深灰色阴影代表后面的轮次）。辅助y轴显示同义（蓝色虚线）和非同义突变（红色虚线）的总数。c，跨轮和谱系的CAZ抗性轨迹的多样性，分组和着色。d，所研究的18个谱系的水平排列，仅突出显示有变化的位置。谱系的排列、分组和颜色如a所示，较深的阴影代表较晚的轮次。
图2、在向CAZ抗性进化过程中，四种关键有益突变的所有组合的适应性景观。a）从祖先KPC-2（底部节点）开始的不同突变轨迹的可及性示意图。b）自适应景观的侧视图，颜色和节点大小约定与图a相同。在合并一个或两个突变后，耐药性迅速趋于稳定，通过编码取代H274Y和V240A的突变组合达到全局适应性峰值。c）个体适应度效应的分布（以CAZ易感性的变化来衡量），表明大多数突变在各个背景中都是中性的或有害的，尽管它们对祖先都是有益的——突出了上位性在该系统中的强度和普遍性。d）在景观中观察到的不同类型的成对上位性的例子。e）上位性类型在整个景观中的分布。
图3、在CAZ抗性演化过程中，对其他β-内酰胺类的侧支敏感性迅速分化。a）针对每个谱系在几轮中累积的非同义突变数量的抗性轨迹。颜色表示基于与CAZ抗性相关的位置的分组，其中蓝色、绿色、黄色和红色分别代表D179Y、H274Y、L169P和S171P。b）跨轮的阻力模式。左上角面板显示每种β-内酰胺类药物的绝对变化（即效应大小）。c）谱系之间和谱系内侧支敏感性的变化。d）沿突变途径的侧支敏感性差异。
图4、平台期内连续突变体的生长率。（a）光密度（OD）在生长的12小时内发生变化。黑线代表野生型KPC-2菌株，灰线代表早期平台菌株，彩色线代表后续菌株。（b）总结上述增长曲线的最大增长率的箱线图。X轴标签（不包括对照菌株）由指示进化线的底部标签（如表S2所示）和指示分离株取自哪一轮的顶部标签组成.
图5、在没有抗生素的情况下沿进化轨迹的生长率。（a）光密度在生长的12小时内发生变化。黑线代表野生型KPC-2菌株，粗彩色线代表第一轮菌株，较细的彩色线代表平台菌株。（b）总结上述增长曲线的最大增长率的箱线图。（c）在没有抗生素的情况下的生长率与存在亚抑制浓度CAZ的情况下测得的生长率呈中等负相关，尽管不显著。
总结
有益突变（即上位性）之间的相互作用通常足够强，可以通过替代突变途径引导适应。尽管替代解决方案在主要选择条件下应表现出相似的适应性，但它们在次级环境中的特性可能存在很大差异。尽管这些神秘差异很重要，但这些隐秘差异在多大程度上是未知的——例如，在识别赋予抗生素耐药性的突变中可利用的附带敏感性方面。研究人员使用定向进化来表征突变途径的多样性，通过这些途径，流行的碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶-2可以进化出针对临床相关抗生素头孢他啶（最初较差的底物）的高活性。本研究确定了40种不同的替换——包括许多在临床环境中常见的——分布在18种不同的突变轨迹中。最初的突变确定了轨迹可以分为四个主要组，这是强上位性的特征。尽管最终头孢他啶耐药性相似，但各组在多个表型维度上存在显着差异，从分子性状（例如细胞内稳定性和催化效率）到宏观性状（例如生长速率和对其他β-内酰胺类抗生素的活性）。Bioscreen C Pro生长曲线分析仪被用于测量KPC-2及其突变体在不同条件下的生长速率，通过生长曲线分析，研究者能够确定不同突变体在CAZ存在和不存在条件下的生长速率差异。这些数据对于理解突变体在不同环境下的适应性具有重要意义，尤其是在评估抗生素抗性进化过程中潜在的适应性成本方面。本研究结果对于理解抗生素抗性进化的复杂性以及设计有效的抗性管理策略具有重要意义。
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