1.3 方法
1.3.1 动物双歧杆菌NX-6的菌株特性测定
1.3.1.1 生长曲线测定
取—80 ℃冻存的动物双歧杆菌NX-6解冻后接种于BS固体培养基上，置于厌氧工作站中（温度37 ℃、相对湿度65%、氧气相对含量0.0%）培养24 h，挑取单个菌落接种于BS液体培养基中继续培养24 h，设置3 个平行组，每2 h取样于600 nm波长处测定OD值，绘制生长曲线。
1.3.1.2 人工胃肠液耐受实验
取—80 ℃冻存的动物双歧杆菌NX-6解冻后接种于BS固体培养基，放置于厌氧工作站中（温度37 ℃、相对湿度65%、氧气相对含量0.0%）培养24 h，挑取单菌落接种于BS液体培养基中继续培养24 h作为种子液。取10 mL种子液离心（6 000 r/min、4 ℃）10 min弃去上清液得菌泥，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2 次后将菌泥重悬于人工胃液（或人工肠液）中，37 ℃消化3 h，在厌氧工作站中分别于0 h和3 h取样，调整菌悬液浓度为10—6～10—7 CFU/mL，涂布于BS固体培养基上培养24 h后测定活菌数，按式（1）计算存活率：
式中：N为0 h时NX-6的活菌数/（CFU/mL）；N*为3 h时NX-6的活菌数/（CFU/mL）。
1.3.1.3 菌株全基因组学测序、组装和注释
取一定量动物双歧杆菌NX-6种子液离心并用PBS洗涤菌泥2 次，再次离心弃去上清液，将菌体送至苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序，具体步骤包括提取基因组DNA、基因组打断、末端修复、加测序接头、纯化DNA和上机测序。对测序结果进行基因组装分析、基因组注释、基因功能注释、特殊结果预测，其中基因功能注释使用了非冗余蛋白质数据库、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库、直系同源集（Cluster of Orthologous Groups，COG）数据库、碳水化合物酶相关的专业数据库、蛋白质家族数据库、致病菌毒力因子（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB）数据库等。
1.3.2 斑马鱼降脂功效实验
1.3.2.1 样品配制
用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制质量浓度为24 mg/mL的阿托伐他汀钙母液，置于4 ℃冰箱备用。实验时调整阿托伐他汀钙溶液质量浓度为2.4 μg/mL；称取0.5 g油红O加入100 mL 1,2-丙二醇溶液中，常温下用磁力搅拌器避光搅拌8 h，充分溶解，再用定性滤纸过滤染液，配成新鲜油红O染液；养殖水配制质量分数为1%葡萄糖溶液；取1.3.1.2节的种子液2 mL，在4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min弃上清液得菌泥，用PBS洗涤2 次，E3养殖水重悬，分别配制成浓度分别为1×104、1×105、1×106 CFU/mL的动物双岐杆菌NX-6菌液用于后续实验。
1.3.2.2 模型构建与药品干预
将每组25 尾受精后5 h的斑马鱼置于6 孔板中，空白组加入4 mL E3养殖水并投喂斑马鱼鱼苗正常饲料，其余组加入4 mL葡萄糖溶液并投喂斑马鱼高脂饲料，28 ℃孵育5 d，每天更换新的溶液。完成模型构建后，弃去上述溶液，空白组和模型组加入4 mL E3养殖水，阳性组加入4 mL阿托伐他汀钙溶液，NX-6低浓度组加入4 mL菌液（1×104 CFU/mL），NX-6中浓度组加入4 mL菌液（1×105 CFU/mL），NX-6高浓度组加入4 mL菌液（1×106 CFU/mL）。各组于28 ℃孵育72 h，每孔每天投喂5 mg饲料并更换新鲜溶液，除空白组喂食斑马鱼正常饲料外，其他组均继续投喂高脂饲料，通过油红O染色情况和TG、TC检测结果判定高脂模型构建是否成功。
1.3.2.3 油红O染色
孵育结束后使用E3养殖水冲洗幼鱼，将幼鱼收集于1.5 mL离心管中，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，4 ℃固定1 d。将离心管中固定的幼鱼倒入24 孔板中，E3养殖水冲洗2 次，用不同体积分数的1,2-丙二醇溶液按以下顺序进行渗透：25% 1,2-丙二醇溶液处理25 min→50%1,2-丙二醇溶液处理25 min→75% 1,2-丙二醇溶液处理25 min→100% 1,2-丙二醇溶液处理25 min。加入质量分数为0.5%油红O染液2 mL（幼鱼完全浸没），锡纸避光，室温染色过夜。洗掉染液，加入体积分数为100% 1,2-丙二醇溶液，去背景色20 min（在显微镜下观察去背景的效果）。在显微镜下拍照观察斑马鱼幼鱼染色情况（脂肪细胞和肝脏脂肪变性染色呈红色）。采用ImageJ 6.0软件进行图像分析并采集数据，分析统计斑马鱼尾部血管血脂光密度总和（S），根据光密度总和的统计学结果按式（2）计算相对脂肪水平，以评价动物双岐杆菌NX-6的降血脂作用。
1.3.3 非靶向代谢组学分析
取1 mL NX-6发酵上清液（记为NX组），加1 mL甲醇-乙腈溶液（2∶1，V/V）和35 μL 0.3 mg/mL内标（L-2-氯苯丙氨酸，用甲醇溶液配制），涡旋振荡至无结块的固液混合物。在冰水浴中超声提取15 min，再涡旋振荡10 min，—20 ℃静置20 min。在15 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min，取200 μL上清液进样测试。以空白BS培养基作为对照（记为BS组），所有样本的提取液分别取30 μL混合制备成质控样本。色谱柱选用AQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脱程序：0～1 min，98% A、2% B；1～9 min，98%～2% A、2%～98% B；9～12 min，2% A、98% B；12～12.1 min，2%～98% A、98%～2% B；12.1～15 min，98% A、2% B。流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，进样体积4 μL。质谱采用双电喷雾离子源，使用Auto MS/MS采集模式，扫描范围为m/z 500～1 300，干燥气流速为8 L/min，干燥气温度为320 ℃，鞘气流速12 L/min，鞘气温度为350 ℃，毛细管电压为4 000 V，喷嘴电压为1 000 V，碰撞能量为10/40 V。
1.3.4 斑马鱼体内的2-吲哚酮、吲哚-3-甲酸含量测定
随机挑选受精后5 d野生型AB系斑马鱼置于6 孔细胞培养板中，每孔30 尾，设置模型组、BS组、NX-6组，每组3 个重复孔。按上述步骤构建模型，构建结束后正常组加入E3养殖水并投喂正常饲料，模型组加入E3养殖水并投喂高脂饲料，BS组加入空白BS培养基，NX-6组加入浓度为1×106 CFU/mL NX-6菌液并投喂高脂饲料，每孔每天投喂5 mg饲料并更换新鲜溶液，置于28 ℃生化培养箱中孵育14 d。干预结束后，每孔随机挑选20 尾斑马鱼，超纯水洗涤3 次后，转移斑马鱼至1.5 mL EP管中加入PBS并匀浆，取50 µL匀浆液加入300 µL沉淀剂，涡旋5 min混匀后在4 ℃、15 000 r/min条件下离心10 min，取上清液于进样瓶中进行液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析（标准曲线同步操作），运用LC-MS/MS仪检测提取液中2-吲哚酮、吲哚-3-甲酸的浓度。
1.3.5 斑马鱼中TG与TC含量测定
构建高脂血症斑马鱼模型，设置空白组（150 mL 0.01% DMSO＋正常饲料）、模型组（150 mL 0.01%DMSO＋高脂饲料）、阳性组（150 mL 2.5 μg/mL阿托伐他汀钙溶液＋斑马鱼高脂饲料）和实验组（150 mL 1×104、1×105、1×106 CFU/mL NX-6菌液＋斑马鱼高脂饲料或25、50、100 μmol/L吲哚-3-甲酸），各组在28 ℃条件下孵育14 d。干预结束后，收集斑马鱼于2 mL EP管中（每组30 尾/管），吸净离心管中的液体，每管加入200 μL PBS，使用组织均质研磨仪将收集到的斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，4 ℃、10 000 r/min离心10 min后取上清液，按照试剂盒说明书分别测定TG、TC含量。
1.4 数据处理与分析
采用GraphPad Prism 6.0软件统计处理数据，结果用表示。
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