摘要：文章从健康婴儿粪便样品中筛选得到8株具有凝乳能力且产蛋白酶能力强的乳杆菌（均为鼠李糖乳酪杆菌）。除对照菌副干酪乳酪杆菌CICC 6110外，所有试验菌株和对照菌鼠李糖乳酪杆菌GG（LGG）在pH 2.5时均表现较强的耐受性；菌株N33、N38、T91和T95在0.2%胆盐环境下表现较强的耐受能力；H48、T91和T95菌株分泌的胞外多糖产量高，均超过400 mg/L；除N33外其余菌株均具有较强的自聚集能力。结果表明，S29、N38、H48、T91以及T95是综合能力较强的菌株，具有极其优良的益生特性，发现,菌株S21的形态结构与其他菌株不同。研究为益生菌产业提供了潜在的菌株资源。
引言
益生菌定义为“当给予足够数量时，对宿主健康有益的活性微生物”。近年来，益生菌已成为食品和健康领域的研究热点。益生菌不仅有助于促进营养吸收、增强人体免疫功能、维持肠道微生态平衡及保护黏膜屏障，还能发挥抗感染、抗癌、辅助治疗过敏性疾病等多种功效。至今为止，已从哺乳动物粪便、阴道分泌物、传统发酵制品等来源中分离出40余种不同的乳酸杆菌，如植物乳植杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌和罗伊氏粘液乳杆菌等，这些共同构成了乳酸杆菌家族。
蛋白酶在食品工业领域中的应用极大促进了富含多肽或必需氨基酸食品的生产。这些食品对于增强人体对蛋白质消化与吸收能力具有显著作用。肠道内存在一定种类的高产蛋白酶微生物群落，它们的存在显著提升了食物中蛋白质消化率，并可作为潜在的膳食补充剂提高机体免疫力。
目前，蛋白酶主要来源包括动物、植物和微生物。其中，动物和植物来源的蛋白酶种类较少，而细菌和真菌来源的蛋白酶因菌株生长迅速、生产成本较低廉、酶种类丰富以及适应性广等优点而受关注。产蛋白酶的细菌主要有乳酸杆菌和芽胞杆菌，然而目前报道的产酶菌种资源有限，难以满足工业化对各类蛋白酶的生产需求。本文通过高效的筛选方法，在健康婴儿粪便样品中分离鉴定高产蛋白酶乳酸杆菌。同时，通过模拟胃液、胆盐耐受性、自聚集能力和表面疏水能力等试验，对所筛选产蛋白酶的乳酸杆菌益生特性进行初步探究，为其作为益生菌应用于食品领域提供理论参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
试验样品来自16名健康婴儿粪便。婴儿月龄均为6个月以内、全母乳喂养，由28~32岁健康母亲自然分娩，且在采样前2周内未服用抗生素或益生菌。所采集样本均来自黑龙江省。对照菌副干酪乳酪杆菌CICC 6110（LP_6110）和鼠李糖乳酪杆菌GG ATCC 53103（LGG）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
MRS培养基（20221215），青岛海博生物技术有限公司；吐温80（20230401），天津市瑞金特化学品有限公司；磷酸盐缓冲液（20231016）、50×TAE缓冲液（20230517）、革兰氏染色试剂盒（20230918），北京索莱宝科技有限公司；琼脂（20220203），德国BioFroxx公司；三氯乙酸（20220919），天津市致远化学试剂有限公司；胃蛋白酶（20220523）、胰蛋白酶（20230806），天津阿尔法生物科技有限公司；猪胆盐（20230314），美国Sigma公司；无水乙醇（20230515）、二甲苯（20221115），天津市富宇精细化工有限公司；GelRed核酸染料BS354A（20230217），北京兰杰柯科技有限公司；引物（20230914），生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA提取试剂盒（20221129）、2×Master Mix（20230611）、6×Loading Buffer（20230811），天根生化科技（北京）有限公司。
1.2仪器与设备
DL-CJ-2NDI超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；TGL-23高速冷冻离心机，四川蜀科仪器有限公司；GR85DA立式压力蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；PB-10台式pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DYY-10C型电泳仪，北京市六一仪器厂；Analytic Jena 96型PCR仪，Biometra GmbH公司；CMax Plus酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；Bioscreen C生长曲线测定仪，美国AB公司。
1.3试验方法
1.3.1产蛋白酶乳杆菌的筛选
用还原液（10 g/L细菌蛋白胨，5 g/L氯化钠，0.5 g/L L-Cysteine HCl，1 mL/L吐温80）对粪便样品进行稀释后涂布在LAMVAB固体培养基表面，对菌落进行革兰氏染色、镜检和H2O2酶试验，选出目标菌种划线培养，直至获得单一菌落，保存于-80℃冰箱中。
初筛。将上述纯化保藏的菌株挑取一环至MRS液体培养基中活化，将牛津杯放置于脱脂乳固体培养基上，取200μL发酵液注入孔中，37℃培养72 h，观察透明圈直径，挑选直径较大的菌株，进行后续试验。
复筛。采用OPA测水解度方法进行蛋白酶活力分析。将试验筛得乳杆菌接种至12%灭菌脱脂乳（115℃，15 min）中，选择凝乳结实的菌株，测定这些菌株蛋白水解度。取5 mL发酵乳样品，加入10 mL 0.75 mol/L三氯乙酸和1 mL蒸馏水后静置10 min。在4℃，6 000g离心10 min，滤膜过滤。取400μL滤液，加入3 mL OPA。室温反应2 min后，于340 nm处测定吸光度。用0~10 mmol/L的L-丝氨酸制作标准曲线进行计算。
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