1.4 RT-qPCR
使用Trizol法提取总RNA，取病毒液和TriQuick Reagent混匀后静置，加入三氯甲烷分离有机相和无机相，离心后取上清，加入等量异丙醇萃取RNA，使用经DEPC水处理的75%酒精洗去残留的异丙醇，加入9.5μL无RNA酶水重悬管底核酸，按试剂盒说明书进行反转录后，使用SYBE Green染料法检测。其中，RT-qPCR反应体系如下:1μL cDNA，10μL 2×AugeGreen qPCR Master Mix，上、下游引物各0.5μL，8μL无菌纯化水。扩增条件为酶激活95℃120 s;然后采用三步法，即95℃5 s，56℃5 s，72℃25 s，共进行45次循环，每个样品重复3次。
1.5免疫印迹(Western blot)
待Vero细胞长满单层后首先用PEDV感染或SLM处理细胞，然后用预冷的PBS洗涤细胞，再用含有蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液裂解，4℃离心后收集上清液，加入上样缓冲液，混匀后105℃变性10 min，然后用SDS-PAGE分离蛋白样品，并转移到PVDF膜上，再用含有5%脱脂奶粉的TBST溶液在室温将PVDF膜封闭2 h，然后加入PEDV N蛋白单克隆抗体(1∶500)、小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1∶10 000)4℃孵育过夜，再用TBST洗涤PVDF膜，然后加入HRP-山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)室温孵育1.5 h，再次洗膜后用ECL发光液检测目的蛋白。
1.6间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescent assay，IFA)
将Vero细胞接种于96孔细胞培养板，待单层细胞长到90%后用PBS洗涤细胞并分组，首先用冰冷的甲醇于-20℃固定细胞10 min，然后用PBS洗涤，使用2%BSA-PBS溶液37℃封闭1 h，然后弃上清，加入PEDV N蛋白单克隆抗体(1∶200)37℃孵育1 h，再用PBS洗涤后加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶500)37℃孵育45 min，再次用PBS洗涤后加入DAPI染色溶液(Bisben Iimde)室温避光显色，洗涤后拍干，最后用荧光显微镜观察结果并拍照，使用Image J统计阳性细胞率。阳性细胞率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100。
1.7半数细胞毒性浓度(CC50)的测定
待96孔细胞培养板中长满单层Vero细胞后用PBS洗涤，并分组，然后用不同浓度SLM处理细胞，并设置只含营养液而没有细胞的孔作为空白对照，继续培养24 h。根据增强型CCK-8细胞活性试剂盒说明书，每孔加入10μL工作液后再置于37℃孵育1 h，最后使用酶标仪读取OD450 nm值。
细胞活力(%)=(OD450 nm天然产物孔-OD450 nm空白对照)/(OD450 nm阴性对照-OD450 nm空白对照)×100。将细胞活力与药物浓度的数据导入到GraphPad Prism 5.0中，使用Analyze下的transform功能，转换成细胞活力与lg(药物浓度)的关系，进一步使用Analyze下的XY analyses的Nonlinear regression非线性拟合功能，利用log(inhibitor)vs.response-Variable slope(four parameters)选项，得到拟合曲线和CC50值。
1.8半数抑制浓度(IC50)的测定
待96孔细胞培养板中长满单层的Vero细胞后用PBS洗涤细胞，然后用不同浓度SLM处理细胞，每个浓度重复8个孔，每孔加入100μL含有相应SLM浓度的维持液预处理细胞1 h，弃掉孔内液体，再用含有0.2 MOI PEDV和相应SLM浓度的混合液处理细胞1 h，并设置仅含有维持液的阴性对照孔和仅接毒不加药的阳性对照孔，最后将孔内液体更换为含有相应SLM浓度的维持液继续培养72 h，肉眼观察CPE并统计。
抑制率(%)=(1-FL天然产物孔/FL阴性对照)×100。将抑制率与药物浓度的数据导入到GraphPad Prism 5.0中，使用Analyze下的transform功能，转换成抑制率与lg(药物浓度)的关系，进一步使用Analyze下的XY analyses的Nonlinear regression非线性拟合功能，利用lg(inhibitor)vs.response-Variable slope(four parameters)选项得到拟合曲线和IC50值。
1.9 SLM对PEDV增殖的抑制作用
将Vero细胞接种于24孔细胞培养板，待长满单层细胞后，弃上清，用PBS洗涤细胞加入含有不同SLM浓度(0.05、0.5、5μmol·L-1)的维持液，在37℃培养箱预处理细胞1 h，随后用PBS洗涤细胞，再用0.2 MOI PEDV感染细胞1 h，然后将病毒液更换为含有相应SLM浓度的维持液，继续培养24 h，收集细胞上清液测定TCID50，提取核酸和蛋白用于测定病毒N基因水平和N蛋白含量，IFA观察病毒分布并计算阳性细胞率。
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