2.5药敏试验结果


由表3可知,药敏试验结果显示,斜带石斑鱼源哈维氏弧菌对环丙沙星(CIP)、诺氟沙星(NOR)、头孢氨苄(CN)、左氧氟沙星(LVX)、米诺环素(MI)、万古霉素(VAN)、庆大霉素(GEN)、氟苯尼考(FFC)、多西环素(DO)、四环素(TET)、阿米卡星(AMK)、亚胺培南(IPM)敏感,对青霉素G(PEN)、氨曲南(AZI)、头孢唑林(CZ)、头孢哌酮(CPZ)、链霉素(S)、氨苄西林(AMP)、哌拉西林(PIP)、头孢呋辛(CXM)、头孢他啶(CAZ)、克林霉素(CC)、红霉素(E)、多黏菌素B(PB)不敏感。


2.6细菌生长曲线

根据不同时间点分光光度计检测结果和活菌计数结果绘制哈维氏弧菌S1的生长曲线(图5、6),结果显示,哈维氏弧菌S1指数生长时间为5~12h,在该阶段中,哈维氏弧菌S1快速增殖,在12h出现峰值,随后OD600下降后趋于平稳,活菌计数结果与OD600的变化趋势基本吻合。


哈维氏弧菌S1的OD600与培养时间的关系表达式为:


Y1=0.0298200+0.0205400X+0.0247900X2-0.0007134X3(R2=0.9977)


哈维氏弧菌S1的菌落形成数量与培养时间的关系表达式为:


Y2=1387675+387588433X-306607341X2+65425698X3(R2=0.5418)


上述公式R2均大于0.4,表明哈维氏弧菌S1的OD600、菌落形成数量与培养时间具有相关性,但公式中哈维氏弧菌S1的菌落形成数量与培养时间的关系表达式R2lt;0.99,不足以作为直接计算公式预测哈维氏弧菌S1菌落形成数量数值,而哈维氏弧菌S1的OD600与培养时间的关系表达式R2gt;0.99,具有预测意义。


3结论与讨论


对暴发病害的湛江斜带石斑鱼养殖场样品Ec 1、Ec 2、Ec 3进行目检时,其皮肤表面的白色隆起疥疮是最显著特征,因此初步怀疑是诺卡氏菌感染导致鱼体皮肤、肌肉和内脏滋生白色结节。但在随后的解剖检查中发现,Ec 1、Ec 2、Ec 3肌肉与内脏均无白色结节,证明并不是诺卡氏菌感染。但Ec 1、Ec 2、Ec 3皮肤病变同常见石斑鱼感染哈维氏弧菌后的症状,如大面积溃烂、暴露肌肉组织,都有明显差异。此外Ec 1、Ec 2、Ec 3肝脏都有充血现象,这同半滑舌鳎感染哈维氏弧菌8-0635症状一致。肝脏细菌分离纯化后鉴定结果同2021年SBY-G的分离纯化后鉴定结果相同,证明哈维氏弧菌S1感染鱼体体内组织,具有致病力。但脾脏糜烂的症状较少在哈维氏弧菌感染的鱼类身上出现,不排除与感染程度有关,也可能还有其他细菌共感染导致这一症状。


16SrRNA是细菌高度保守的基因,是对细菌进行分类与鉴定的重要参考标准之一,选择这一基因对哈维氏弧菌S1进行分类鉴定。哈维氏弧菌S1的16SrRNA的鉴定结果同2018年被报道的V.harveyihq-V149明确地聚为一支,同其他主要流行的哈维氏弧菌分类地位较远,说明哈维氏弧菌S1感染途径更易追踪,并且对海水养殖中的哈维氏弧菌传播途径的相关研究具有更深意义。


16S rRNA鉴定结果与药敏结果结合,让它的药敏试验更具研究意义。与其他哈维氏弧菌药敏试验结果进行比较,其他石斑鱼源哈维氏弧菌毒株敏感的氯霉素,哈维氏弧菌S1对其变成了中度敏感,而其他石斑鱼源哈维氏弧菌毒株不敏感的抗生素,如链霉素,哈维氏弧菌S1依旧不敏感。当然也有其他石斑鱼源哈维氏毒株不敏感的四环素,哈维氏弧菌S1却对其敏感,而从患病泥蚶上分离出的哈维氏弧菌J14等同样对四环素敏感,却与哈维氏弧菌S1同源性并不高。哈维氏弧菌S1在药敏试验中同其他毒株有差异的结果进一步体现了它在传播途径和进化地位上与较多报道的致病哈维氏弧菌的差异性,证明其研究价值。这对研究不同毒株哈维氏弧菌毒力因子差异以及造成的病理现象差异有一定参考价值,而对不同毒株的哈维氏弧菌感染后是否会造成转录水平和蛋白水平的差异化表达的研究,也是未来需要哈维氏弧菌S1的分离与鉴定作为研究基础的研究之一。


为后续对斜带石斑鱼源的哈维氏弧菌S1研究试验准备,对哈维氏弧菌S1的生长曲线进行绘制,发现哈维氏弧菌S1在5h时OD600进入0.4~0.6范围,随后快速增长,因此哈维氏弧菌S1在5h时进入对数增长期。而在12h后进入平台期,但活菌计数结果显示,16h是菌落形成数量结果最高的时间点。而在16h之后,菌落形成数量有明显下降,但OD600数值稳定,证明此时哈维氏弧菌S1进入衰亡期,TSB液体培养基中总菌数没有明显变化,但活菌数快速减少。哈维氏弧菌S1OD600和菌落形成数量的生长曲线证明,OD600和菌落形成数量并不成线性关系,无法通过时间或者OD600检测结果直接预测菌落形成数量,但时间和OD600检测结果同菌落形成数量仍存在相关性。根据生长曲线绘制结果,可以判断,5~16h是哈维氏弧菌S1的对数生长期,活性强,适宜使用这期间的菌液进行试验。


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