3. 确定生长参数
3.1. 生长参数的定义
如上所述，初始细胞密度（N₀）、延滞期（λ）、生长速率（μ）和最大细胞密度（N_max）是微生物的主要动力学生长参数。延滞期（λ）是一个重要参数，在单细胞建模中得到了广泛研究。在群体水平上，延滞期（λ）的传统几何解释是接种水平线与微生物生长曲线上指数部分切线的延长线之间的交点时间。由于经典的延滞期（λ）缺乏微生物学意义，有学者指出，对于单细胞，延滞期（λ）的生物学定义是为适应新环境和完成第一次分裂所需的生理时期。然而，由于复杂的细胞内生理过程，单个细胞的延滞期（λ）分布是随机的。生长速率（μ）也被用作单细胞的基本参数；通常可以从对数坐标的生长曲线斜率中获得。例如，最大比生长速率（μ_max）定义为曲线指数部分的最大斜率。此外，由于对微生物延滞期生理机制的了解不足，延滞期（λ）比比生长速率（μ）更难预测。
3.2. 生长数据的生成
由于其体积小，检测和分析单细胞很困难。另一方面，为了准确估计具有高度变异性的单细胞生长，需要高质量的数据。数据必须通过实验收集。用于连续获取实验数据的高灵敏度方法对于成功进行单细胞预测建模极为重要。此外，传统的用于监测微生物生长的活菌计数方法并不适用。这不仅是因为计数劳动强度大且耗时，更重要的是因为它无法检测到活的但不可培养的细胞。在本节中，将介绍几种用于单细胞研究数据生成的方法。
3.2.1. 光密度测量
连续稀释法与光密度测量的结合使得间接收集单细胞生长数据成为可能。OD测量的原理是光值与微生物浓度成正比，由比尔-朗伯定律规定。已经开发出用于OD测量的快速分析设备，例如Bioscreen C，能够同时从多个孔（200个）进行采样。在早期，OD方法主要用于模拟微生物种群生长。然而，限制OD测量在单细胞研究中应用的主要缺点是检测阈值较高（10⁶-10⁷ 细胞/毫升）。为了克服这个缺点，有研究者利用一种新的数值方法来估计单个细胞的延滞期（λ），该方法基于检测时间（T_d），检测时间被定义为从低初始接种量到恒定检测水平的时间段：
其中 N_d 是 T_d 时的细胞数，N₀ 是初始细胞数，μ 是比生长速率。他们对接种物进行连续稀释以确保每个孔中有一个细胞。然后，通过Bioscreen C设备连续监测所有稀释液的OD值。通过绘制检测时间与初始细胞数对数的关系图，确定了单细胞的延滞期（λ）和比生长速率（μ）。这种到达检测时间法已成功用于获取单个细胞的生长数据。此外，可以使用校准曲线代替直接应用OD值，将悬浮液的浊度测量值转换为细胞数的对数。
因此，OD测量可以在一定程度上为单细胞动力学参数提供支持，但由于无法直接观察细胞，无法深入了解单细胞生理特性的变异性。
3.2.2. 显微镜和图像分析技术
显微镜和计算技术的快速发展产生了许多有用的显微镜和分析方法，可以直接观察放置在琼脂平板上的单个细胞的生长。这种直接方法具有方便记录细胞在生长和分裂过程中的大小、形状和体积变化以用于建模的优点。然而，随着子细胞数量的增加，视野变得难以观察，并且使用普通显微镜无法检测到单细胞。为了克服这一限制，有研究者设计了一个流动室显微镜系统，并结合了流动室技术（见第2.3节）。在他们的系统中，子细胞通过快速流动的剪切力被移除。同时，初始细胞粘附在固体表面上以供观察（图5）。该方法的优点包括：(1) 连续观察初始单细胞的生长；(2) 可以进行高通量分析；(3) 流动液体的特性发生变化，使得检测影响个体细胞生长的因素成为可能。由于这些优点，它已被广泛应用于许多单细胞研究中。然而，在观察期间，细胞仍有可能自然地从表面脱离。有研究者发现，在细胞分裂期间，数字图像的盒面积比会出现突然增加。使用BAR，可以确定首次分裂的时间。随着荧光标记、显微镜和计算技术的优化，更先进的显微镜方法与荧光结合用于观察和监测微生物细胞。激光扫描显微镜广泛用于荧光介导的单细胞分析。有两种优化的LSM类型：共聚焦激光扫描显微镜和双光子激光扫描显微镜。这些方法有助于消除荧光背景信号。这些先进技术使得观察微生物细胞内事件成为可能，例如基因表达和蛋白质合成。
基于菌落生长的图像分析方法已经被开发用于监测单细胞动力学。例如，有研究者提出了一种图像处理系统来测量菌落的空间强度阈值。然而，这种方法可能更适合观察霉菌的菌丝生长。
3.2.3. 流式细胞术
借助荧光染色，流式细胞术是另一种可用于微生物生长研究的强大技术。荧光标记的细胞在流动液体中逐个通过光源，可以测量单个细胞的荧光信号并将其转化为关于结构和功能特性的信息，例如大小、形状和细胞内含物（DNA、RNA、蛋白质）。此外，针对不同细胞位点的不同荧光染料使得获取生理参数成为可能，包括代谢活性、膜完整性和电位以及细胞内pH值。例如，有研究者利用流式细胞术，使用两种荧光素：5(6)-羧基荧光素二乙酸酯混合异构体和碘化丙啶，对无害李斯特菌中膜透化和酯酶活性这两个生理参数的变异性进行了建模。然而，流式细胞术的局限性在于它不能连续观察细胞。改进后的流式细胞术，即激光扫描细胞术，涉及当细胞固定在固体玻片或膜滤器上时检测激光信号。它可以用于同一细胞的长期观察。然而，细胞的光漂白可能是一个挑战。另一种替代方案是成像流式细胞术，它利用传统或先进的显微镜直接在玻片上观察感兴趣的细胞。
3.2.4. 芯片实验室法
为了在受控微环境中长时间有效观察单细胞，芯片实验室装置已被开发出来，在这些装置中，单细胞可以在微型反应器或捕获装置中被观察和分析。微流控装置也被引入用于检测和记录单个细胞的行为。微流控捕获装置由两种类型的固定体积元件组成，如液滴和带有持续培养基供给的微流控通道。对于微流控通道装置，有研究者提出了一种称为“母机”的微流控捕获装置，其中单细胞被隔离在微孔中，微孔的顶部通向一个流动通道（图6）。在观察期间，含有营养物质或应激物质的培养基通过通道连续供应，废物和子细胞被流动冲走。借助高分辨率延时显微镜和荧光标记技术，可以观察到细胞伸长率、细胞大小变化和生长情况。
相关新闻推荐
2、一氧化碳支持微生物厌氧还原脱氯，拓展脱卤拟球菌生长条件的多样性