3讨论
研究报道，在正常膀胱黏膜上皮和黏膜固有层组织中，有大量的CD4+、CD8+T细胞和DC细胞存在，而巨噬细胞只少量存在于固有层组织中。但是，膀胱癌组织中免疫细胞的分布情况并不清楚。因此，我们进行了前期研究，结果表明除CD3、CD8外，巨噬细胞表面特征性CD68分子在癌组织的间质细胞中的染色呈强阳性，而CD68在癌旁正常组织中的表达呈阴性，提示巨噬细胞在膀胱癌组织中的浸润增多可能与膀胱癌的发生和发展有密切关系。
巨噬细胞是在组织中定植分化的单核细胞，具有吞噬活性，通常根据其分化状态和功能作用分为M1和M2亚型。M1巨噬细胞具有促炎特性(例如分泌IL-12和活性氧)，可以识别和杀伤肿瘤细胞；M2巨噬细胞具有抗炎特性，并分泌IL-10，生长因子-β(TGF-β)，和促血管生成因子等，可以促进肿瘤细胞的增殖和转移。在肿瘤组织中，M1巨噬细胞数目越多，患者预后越好；反之，M2巨噬细胞数目多，则患者预后较差。本研究采用免疫组化实验检测M1和M2型巨噬细胞表面特征性标志分子在膀胱癌组织中的表达情况，发现M2型巨噬细胞表面特征性分子CD163在癌间质细胞中的表达明显升高，提示M2型巨噬细胞在膀胱癌微环境中聚集增多，可能与膀胱癌的发生、发展存在密切关系。
研究报道，早期的肿瘤细胞可分泌CCL2、IL-10、TGF-β等募集单核细胞至上皮内并向M2型巨噬细胞极化，成为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated machrophage，TAM)。反过来，TAM又可分泌IL-10、TGF-β、EGF、Wnt等影响肿瘤细胞内信号传导通路，引起肿瘤细胞的增殖和转移。因此，TME中的TAM可通过调控肿瘤细胞内相关的信号通路促进肿瘤的发生、发展。为筛选巨噬细胞调控的下游靶点基因，本研究通过对膀胱癌和癌旁组织的转录组测序并结合膀胱癌组织中浸润的免疫细胞评分方法，筛选出受巨噬细胞调控的下游靶点基因CLDN10。CLDN10蛋白分子定位于细胞膜，是claudin家族成员之一，而claudin家族构成了上皮细胞和内皮细胞间的分子屏障，是细胞间紧密连接(tight junction，TJ)的重要组成之一。近年来的研究表明，CLDN10的表达异常或功能失调与人体肿瘤的发生和进展有密切关系，CLDN10的表达与甲状腺癌、卵巢癌、结直肠癌和肾癌等肿瘤患者的预后呈负相关。在膀胱癌中，TCGA数据库分析结果表明CLDN10的表达与膀胱癌患者的预后呈负相关。国内也有研究报道CLDN10在膀胱癌组织表达，且CLDN10表达失调可能与膀胱癌的发生、发展过程相关。但是巨噬细胞调控CLDN10基因表达的具体作用机制尚不清楚。
国外研究结果表明，巨噬细胞可分泌TNF-α，TNF-α可促进肝癌、皮肤癌等肿瘤细胞的增殖。SCHMITZ等研究发现TNF-α可以影响TJ蛋白的结构和功能造成小肠上皮的分子间屏障的破坏，引起小肠炎。本研究结果也表明，当敲低膀胱癌细胞中CLDN10的表达后，膀胱癌细胞的生长能力和细胞克隆形成能力明显下降，说明CLDN10具有促进膀胱癌细胞生长和增殖的能力。
膀胱癌是一种高度恶性的肿瘤，易通过淋巴结引流发生远处转移。众所周知，肿瘤细胞的细胞上皮-间质转化(EMT)使细胞失去极性和细胞间的分子屏障，导致细胞的运动能力加强，促使肿瘤细胞发生转移。CLDN10作为上皮细胞膜上的紧密连接蛋白重要构成之一，通过使细胞之间形成紧密结合而构成了细胞间的屏障，限制了细胞的运动活性和分子物质在细胞间的滤过。那么，CLDN10在膀胱癌组织中高表达是否会促进膀胱癌细胞转移呢？有研究表明，CLDN10的表达降低或在细胞膜上的定位减少则可以引起细胞极性和运动能力的改变，从而促进肿瘤细胞的转移。那么，CLDN10的高表达与膀胱癌细胞EMT是否相关呢？本研究结果表明，当敲低膀胱癌细胞CLDN10的表达后，EMT相关蛋白Snail、Vementin、Twist的表达水平下降，说明CLDN10具有促进膀胱癌细胞EMT发生的能力。
本研究对膀胱癌肿瘤微环境中巨噬细胞促进膀胱癌细胞的增殖和转移的机制进行了初步探索，通过体内外基因测序的方法联合膀胱癌微环境免疫评分的方法筛选出与巨噬细胞调控相关的CLDN10基因，并通过软件分析和查阅文献的方法对巨噬细胞调控CLDN10基因促进膀胱癌细胞增殖和转移的机制进行了初步探索，证明了CLDN10与膀胱癌的增殖和转移有关，但是这一过程是否与巨噬细胞的调控相关及其具体的作用机制仍尚不清楚，需要进一步深入地研究。从长远打算，研究巨噬细胞促进膀胱癌细胞发生、发展的分子机制，可以为免疫治疗膀胱癌提供新的理论依据和治疗策略，研究意义重大。