鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又称鸭瘟病毒，可引起鸭病毒性肠炎，是一种泛嗜性全身性感染的病毒，也是危害养鸭业最为严重的病原之一。该病毒对不同品种、年龄的鸭均可致病。患病鸭临床表现为急性败血症过程，其特征是血管损伤，体腔溢血，消化道出血、炎症和坏死等。
DEV属于疱疹病毒科马立克病毒属，具有基因组大、非必需基因多、遗传稳定性好等特性。这些特性使DEV作为病毒载体成为可能。以DEV为载体，已成功表达了小鹅瘟病毒VP2基因、新城疫病毒F基因、H5N1型高致病性禽流感病毒HA基因。在DEV基因组中插入报告基因可快速高效地筛选重组病毒。目前常用绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及β-半乳糖苷酶基因(LacZ)标记重组病毒。
孙莹等通过同源重组将GFP表达盒插入DEV UL2基因，筛选并纯化了表达绿色荧光蛋白的UL2基因缺失的重组DEV。但研究发现GFP在DEV中不能稳定表达，随着重组病毒的不断传代，GFP会发生点突变或缺失，因此有必要筛选更加稳定的报告基团。
本研究将带有RFP的UL2基因缺失转移载体pT-UL2-RFP与DEV共转染鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)，经过5轮蚀斑筛选、纯化，获得表达RFP的重组DEV，通过测定重组病毒及其亲本毒的一步生长曲线以及用PCR测定不同代次重组病毒的RFP序列，以期获得更稳定的报告基因，为后期重组病毒的筛选奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1主要试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自北京NEB公司；Ex Taq DNA聚合酶购自大连TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒小提中量试剂盒等均购自天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清、M199培养液购自Hyclone公司；OPTI-MEM培养液购自Gibco公司；7.5%NaHCO3购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1.1.2菌(毒)株与细胞DEV细胞适应毒以及重组质粒pT-UL2-GFP-gpt、pT-RFP由中国兽医药品监察所菌种保藏与检测室构建、保存；DH5α受体菌购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.1.3 SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。
1.1.4鉴定引物ORFC17F：5’-ATGGCCGACG-ATAGGCT-3’，ORFC17R：5’-TTATACTGTTCCACAAGG-3’，由赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)合成。
1.2试验方法
1.2.1重组质粒pT-UL2-RFP构建重组质粒pT-UL2-GFP-gpt用限制性内切酶NheI-HF、BamH I-HF双酶切，切除重组质粒GFP-gpt表达盒，回收6.2 kb片段，质粒pT-RFPNX用限制性内切酶NheI-HF、BamH I-HF双酶切，回收大小为711 bp RFP片段，通过T4 DNA连接酶将RFP替换GFP-gpt，构建重组质粒pT-UL2-RFP。
1.2.2重组病毒的制备、纯化DEV细胞适应毒接种CEF(MOI=0.01)，吸附1～2 h后，按Lipofectamine 3000说明书转染高纯度质粒pT-UL2-RFP。转染后72～96 h，观察细胞病变情况，待80%细胞产生病变后，反复冻融3次，接种于新鲜CEF单层的六孔培养板中，用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖，37℃、5%CO2培养箱中培养48～72 h。观察荧光，挑取单个有红色荧光的蚀斑，在细胞上重复多次传代，直至所有的蚀斑都带有红色荧光，确定为纯化的重组病毒。
1.2.3重组病毒基因组
DNA的提取取重组DEV病毒液437.5μL，加入蛋白酶K(20 mg/mL)12.5μL，10%SDS 50μL；56℃水浴1 h；分别用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提一次；取上清，加入1/10体积3 mol/L醋酸钠和两倍体积的无水乙醇，-20℃放置30 min；12000 g离心10 min，去除上清后，70%乙醇洗涤沉淀一次，沉淀溶于30μL去离子水中，-20℃保存备用。
1.2.4重组病毒鉴定
重组病毒DNA用鉴定引物ORFC17F、ORFC17R进行PCR扩增，PCR产物送北京华大基因生物公司测序。
1.2.5一步生长曲线
将重组病毒及其亲本毒分别接种于8瓶25 cm2(MOI=0.01)的CEF中，接种后每隔12 h取出一瓶接毒细胞，收集细胞培养液上清作为上清样品，再加入1 mL含有1%FBS的M199细胞维持液，冻融后取上清作为细胞样品。将重组病毒及亲本毒的病毒悬液做10倍系列稀释，取4个适宜稀释度，接种新鲜的CEF单层96孔细胞培养板，每孔接0.1 mL，每个稀释度接5孔，37℃吸附1 h后每孔加入0.1 mL细胞维持液，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d。观察致细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)，记录每个稀释度出现CPE的孔数，按Reed-Muench法计算病毒TCID50，并绘制一步生长曲线。
1.2.6重组病毒的稳定性
将重组病毒接种CEF(MOI=0.01)，待80%细胞产生病变后，反复冻融3次，再接种CEF，按此方法连续传代12次。荧光显微镜下观察每代重组病毒的红色荧光表达情况。按1.2.3方法提取第5代、第10代、第12代病毒DNA，用鉴定引物ORFC17F、ORFC17R通过PCR鉴定外源基因RFP是否稳定存在。PCR产物送北京华大基因公司进行测序。