变形链球菌形成生物膜和在酸性pH下存活的能力被认为是龋齿发病机制中的两个重要毒力决定因素。环境刺激被认为通过双组分信号转导系统的活性来调节几种与毒力因子相关基因的表达。然而，关于这些系统在变形链球菌生理和致病性中的作用知之甚少。
在本研究中，我们描述了一个双组分调控系统及其在变形链球菌生物膜形成和酸耐受性中的作用。通过使用肺炎链球菌的HK03和RR03蛋白序列作为查询词，在变形链球菌基因组数据库中进行tblastn搜索，我们鉴定出两个基因，命名为hk11和rr11，它们分别编码一个推定的组氨酸激酶及其同源应答调节蛋白。为了深入了解它们的功能，我们采用PCR介导的等位基因交换诱变策略，从变形链球菌野生型NG8中创建了hk11（Emʳ）和rr11（Emʳ）缺失突变体，分别命名为SMHK11和SMRR11。对这些突变体的生长速率、遗传感受态、形成生物膜的能力以及对低pH挑战的耐受性进行了检测。结果显示，删除hk11或rr11会导致生物膜形成缺陷和对酸性pH的耐受性降低。两种突变体形成的生物膜生物量减少（约为亲本菌株密度的50%至70%）。
扫描电子显微镜观察显示，突变体形成的生物膜具有海绵状结构，其中似乎存在大的间隙，类似于水通道样结构。突变体的生物膜由比亲本生物膜更长的细胞链组成。删除hk11还导致对低pH的耐受性大大降低，尽管我们在删除rr11时没有观察到相同的效果。两种突变体的遗传感受态均未受影响。结果表明，变形链球菌中hk11的基因产物可能作为pH传感器，可以与一个或多个应答调节蛋白发生交叉对话。我们得出结论，由hk11和rr11编码的双组分信号转导系统代表了一个参与变形链球菌生物膜形成和酸耐受性的新调控系统。
双组分信号转导系统通过感知环境变化并调节基因表达以响应各种刺激，在细菌适应、生存和毒力中发挥作用。一个典型的双组分调控系统包括一个膜相关的组氨酸激酶传感器蛋白（感知特定的环境条件）和一个细胞质应答调节蛋白（当条件变化时通过调节基因表达使细胞能够响应）。在受到特定配体或信号刺激时，组氨酸激酶传感器蛋白在保守的组氨酸残基处发生自身磷酸化。然后，磷酸基团被转移到同源应答调节蛋白，后者进而可以激活或抑制靶基因的转录。已有研究表明，双组分调控系统在多种细菌物种中调节多样的代谢过程、细菌细胞周期、细胞间通讯和毒力因子。由于它们在调节细胞生理、环境适应和毒力表达方面的重要性，双组分调控系统已被用作开发抗菌剂的目标。
变形链球菌是一种进化出生物膜生活方式以在其自然生态系统——牙菌斑中生存和持续存在的细菌。在适当的环境条件下，变形链球菌可以从膳食可发酵碳水化合物产生足够量的酸，并导致牙釉质脱矿-再矿化过程失衡，从而引发龋齿。变形链球菌引发龋齿的能力取决于几个与毒力相关的特性，包括：（i）通过在其合成的不溶性细胞外多糖促进下粘附并积聚在牙齿表面来启动生物膜形成；（ii）高效分解碳水化合物并产酸；以及（iii）在低pH下生长和继续代谢碳水化合物的能力。环境因素在调节变形链球菌这些毒力相关特性中起着重要作用。尽管有许多研究证明了环境刺激在调节变形链球菌生理和毒力特性方面的重要性，但关于变形链球菌响应其环境波动而调节这些毒力特性表达的分子机制知之甚少。
我们最近在变形链球菌中描述了一个由双组分系统（ComDE）组成的群体感应信号系统。该系统响应其天然信号肽信息素并激活许多对诱导遗传感受态至关重要的基因的转录，导致自然转化。我们之前的工作表明，该系统似乎在变形链球菌的遗传感受态、生物膜形成和酸耐受反应中扮演全局调控角色。在本研究中，我们描述了一个新的双组分调控系统，并开始评估该系统在变形链球菌生物膜形成和酸耐受性中的作用。
材料与方法
细菌菌株、培养基和化学品。 本研究使用的菌株及其相关特性列于表1。变形链球菌野生型菌株NG8常规在Todd-Hewitt酵母提取物琼脂平板上传代培养，而突变体则在THYE琼脂中加入10μg/ml红霉素进行维持。除非另有说明，常规使用THYE液体培养基培养菌株。为了培养生物膜，制备了一种半限定最小培养基，该方法是对先前描述的方法的修改。该培养基含有58 mM K₂HPO₄、15 mM KH₂PO₄、10 mM (NH₄)₂SO₄、35 mM NaCl和2 mM MgSO₄·7H₂O，并补充了过滤灭菌的维生素、氨基酸、0.2% Casamino Acids和20 mM葡萄糖。所有菌株的生物膜在聚苯乙烯微孔板中于SDM培养基中，37°C，5% CO₂条件下培养16小时后进行定量和显微镜检查。
| 菌株/扩增子/质粒 | 相关特性 | 来源或参考文献 |
|---|---|---|
| 变形链球菌菌株 | ||
| NG8 | 野生型，Emˢ（红霉素敏感） | A. S. Bleiweis，佛罗里达大学 |
| SMHK11 | NG8△hk11::PcEm，Emʳ（红霉素抗性） | 本研究 |
| SMRR11 | NG8△rr11::PcEm，Emʳ | 本研究 |
| 扩增子 | ||
| PcEm | 带有合成启动子的Emʳ标记，从ermAM盒扩增 | 参考文献4 |
| aHK11 | HK11-up::PcEm::HK11-dw，用于hk11的等位基因替换 | 本研究 |
| aRR11 | RR11-up::PcEm::RR11-dw，用于rr11的等位基因替换 | 本研究 |
| 质粒 | ||
| pDL289 | 大肠杆菌-链球菌穿梭载体；Kmʳ（卡那霉素抗性） | 参考文献2 |
| 引物 | 核苷酸序列（5'→3'） | 扩增子大小（bp） |
|---|---|---|
| HK11-P1 | CTGAAGGAAGCCTTATGCG | 763 |
| HK11-P2 | GGCGCGCCCCGGAAATGATGGTAACTGCCG | - |
| HK11-P3 | GGCCGGCCAAGTGCTGAAAAGGGGG | 666 |
| HK11-P4 | CATAGACAACGGCTTGGGTC | - |
| RR11-P1 | AACGCCACCTCAACCAAA | 887 |
| RR11-P2 | GGCGCGCCGCCTCACCGATAACTTCTACATT | - |
| RR11-P3 | GGCCGGCCCCTTCAGCATCATTTAGTGCCAC | 565 |
| RR11-P4 | CACCCACATCCTCAAAGGTC | - |
| Em cst-P1 | GGCGCGCCCCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT | 860 |
| Em cst-P2 | GCTGGCCGGCCAGTCGGCAGCGACTCATAGAAT | - |
构建hk11和rr11缺失突变体。 我们开始搜索俄克拉荷马大学OU-ACGT网站的变形链球菌基因组数据库，寻找在肺炎链球菌中鉴定出的13个TCSTSs的同源物。使用肺炎链球菌的HK03和RR03蛋白序列作为查询词进行tblastn搜索，鉴定出两个与肺炎链球菌的hk3和rr3基因同源的基因。这两个基因被命名为hk11和rr11，分别编码变形链球菌中一个推定的组氨酸激酶及其同源应答调节蛋白。本研究重点评估这个命名为HK/RR11的TCSTS在变形链球菌生物膜形成和酸耐受性中的功能。我们通过一个快速的基于PCR的缺失策略，在变形链球菌野生型菌株NG8中构建了hk11和rr11基因的单独缺失突变体，该策略涉及限制性内切酶连接和等位基因替换，如先前所述。用于构建和确认基因缺失的引物列于表2。例如，为了构建hk11突变体，使用引物HK11-P1和HK11-P2（其5'端含有一个AscI位点）从变形链球菌NG8基因组DNA中扩增出hk11起始密码子5'端的763 bp片段（HK11-up）。另一个扩增子，命名为HK11-dw，是hk11 3'端的666 bp片段，使用HK11-P3（5'端带有FseI位点）和HK11-P4引物扩增。一个红霉素抗性标记PcEm（860 bp），来自合成的Emʳ盒，使用引物Em cst-P1和Em cst-P2（其5'端分别设计了AscI和FseI位点）进行扩增。这些扩增子经过限制性内切酶消化和随后的连接，产生HK11-up::PcEm::HK11-dw片段。连接产物直接用于转化变形链球菌野生型菌株NG8，并借助合成的感受态刺激肽。通过双交换同源重组后，hk11基因的内部区域被红霉素盒完全替换。使用类似的策略构建rr11缺失突变体。
通过PCR确认突变体中PCR构建体的整合位点。简而言之，通过先前描述的方法从在THYE-红霉素（10μg/ml）琼脂平板上选择的转化子中制备基因组DNA。然后使用突变体和野生型基因组DNA作为模板，用三种引物组合（P1和Em cst-P2，P4和Em cst-P1，以及P1和P4）进行PCR，根据预测的产物大小验证构建体正确重组到突变体基因组中。使用野生型（NG8）基因组DNA作为阴性对照。
生长速率。 在SDM培养基和补充了20 mM葡萄糖的胰蛋白胨-酵母提取物培养基中培养菌株，使用Bioscreen微生物生长曲线分析仪（Bioscreen C Labsystems, Helsinki, Finland）和一次性多孔微孔板测定它们的生长动力学。Bioscreen配备了允许记录浊度读数并将其转换为生长曲线的软件。将等浊度的细胞悬浮液等分试样（4μl）接种到每个含有400μl新鲜培养基的孔中。在总共20小时内，每15分钟短暂摇动后记录培养物的浊度。每个样品进行三次重复测定，并使用三个无细胞的孔作为空白对照。
遗传转化。 为了确定hk11或rr11的失活是否对遗传感受态的发展有任何影响，使用先前描述的方案检测突变体的遗传转化能力。简而言之，将过夜培养物用2 ml预温的新鲜THYE肉汤（补充了5%马血清）稀释，生成1:20和1:40的稀释液。将培养物在37°C、5% CO₂条件下培养2小时，使浊度达到600 nm处光密度为1.5至2.0单位。然后将每个样品分成两份：一份含有1μg/ml转化质粒DNA（pDL289, Kmʳ），另一份含有相同浓度的转化质粒DNA和新鲜制备的CSP（终浓度为500 ng/ml）。培养2至3小时后，轻轻超声处理10秒以分散链球菌链，将细胞悬浮液等分试样（100μl）涂布在含有卡那霉素（700 ng/ml）的THYE平板上。将适当稀释后的细胞悬浮液等分试样也涂布在不含抗生素的THYE平板上以确定总受体细胞数。亲本菌株NG8的转化作为阳性对照。转化频率表示为每毫升细胞悬浮液中转化子数除以总受体细胞数。