2.5没食子酸对溶藻弧菌生物被膜的清除作用
不同浓度没食子酸对溶藻弧菌成熟生物被膜清除的影响如图5所示。与对照组相比，1/2MIC、1MIC和2MIC的没食子酸溶液能显著清除成熟的溶藻弧菌生物被膜(P<0.05)，清除率分别为54.5%、67.54%和68.01%。结果表明，1/2MIC以上浓度的没食子酸对溶藻弧菌成熟的生物被膜清除作用明显，且清除作用随其浓度的增加而增强。
2.6没食子酸对溶藻弧菌泳动能力的影响
a：1/2MIC；b：1/4MIC；c：未添加。
a:1/2MIC;b:1/4MIC;c:No addition.
没食子酸对溶藻弧菌泳动的影响如图6、7所示。1/2MIC和1/4MIC浓度的没食子酸对溶藻弧菌泳动能力有显著的抑制作用(P<0.05)，较对照组分别减少60.41%(P<0.05)和51.78%(P<0.05)，2MIC和1MIC浓度的没食子酸能完全抑制溶藻弧菌的生长，平板上未见细菌生长。结果表明，1/4MIC以上浓度的没食子酸能显著抑制溶藻弧菌的泳动能力，且抑制作用随浓度的增加而增强。
2.7没食子酸对溶藻弧菌聚集能力的影响
不同浓度没食子酸对溶藻弧菌聚集能力的影响如图8所示。阳性对照组细菌间的聚集能力为44.08%，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC浓度的没食子酸能显著降低溶藻弧菌的聚集能力，聚集能力分别被降至37.41%、25.70%、19.19%和18.68%，与对照组相比差异显著(P<0.05)。
讨论
随着生活水平的提高，人们对于食品安全的关注度越来越高，2021年1月农业农村部印发了《关于加强水产养殖用投入品监管的通知》，其中指出开展水产养殖用兽药、饲料和饲料添加剂相关违法行为三年专项整治，在全国试行水产养殖用投入品使用白名单制度。但目前合规的水产动物疾病防治药物较少，加之养殖模式和病原区系特征的不断变化，寻找绿色高效的防治药物成为当前水产病害防治的研究热点之一。
没食子酸作为一种多酚类化合物，广泛存在于植物中，也可通过生物或化学合成方式大量获得，具有较好的抗菌活性。研究证实，没食子酸对迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)等４种水产动物致病菌的抑菌圈直径可达25~30 mm。研究结果显示，没食子酸对副溶血弧菌的MIC为3 mg/mL。本研究结果显示，没食子酸对溶藻弧菌的MIC和MBC分别为4 mg/mL和8 mg/mL，MBC/MIC为2，说明没食子酸对溶藻弧菌具有良好的杀菌作用；生长曲线测定结果表明，4 mg/mL以上浓度的没食子酸能完全抑制溶藻弧菌生长，2 mg/mL的没食子酸明显抑制溶藻弧菌的快速生长，生长平台期菌液浓度明显低于阳性对照组，提高没食子酸药物浓度可缩短药物的抑菌作用时间，说明没食子酸对溶藻弧菌的抑制效果呈剂量依赖性，因此，选用没食子酸抑制溶藻弧菌生长时，应选用4 mg/mL及以上浓度方能达到良好的抑菌作用。
当细菌的细胞壁和细胞膜遭到破坏时，细胞膜通透性增高，细胞内容物流出，细菌胞外的AKP活性和电导率会显著升高。研究发现，没食子酸能使高敏感菌单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)出现凹陷、破损、细胞原生质泄漏。地榆提取物能破坏多重耐药大肠埃希氏菌(multidrug-resistant Escherichia coli)的细胞壁，显著提高胞外的AKP含量。本研究中1、2、4、8 mg/mL浓度的没食子酸能在2 h内破坏溶藻弧菌的细胞壁，导致AKP漏出；没食子酸能使溶藻弧菌培养物的电导率增加，说明没食子酸也可破坏溶藻弧菌细胞膜的完整性，导致通透性增加，且破坏程度呈剂量依赖性。
生物被膜是由细菌分泌的胞外多聚物(EPS)组成，如蛋白质、胞外多糖、脂质和细胞外DNA，生物被膜有利于微生物黏附，能提高细菌对外界不良坏境的抵抗能力，同时增加细菌对抗菌药物的抗性。多项研究指出，细菌的运动性和聚集能力在细菌早期粘附、生物被膜形成和细菌定殖过程中发挥着重要作用，细菌通过运动相互聚集，借助EPS粘附更多的游离菌，从而更加有利于生物被膜的形成，同时细菌间的聚集可促进其粘附，使生物被膜结构更加坚固。研究发现，多酚类物质能通过破坏细胞壁和细胞膜、减少生物被膜形成、干扰细菌运动和聚集能力等发挥对细菌的抑制效果。没食子酸可诱导大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物被膜特性发生不可逆变化。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和肉桂醛衍生物能抑制副溶血弧菌的运动能力和生物被膜形成。
虾壳壳聚糖–表没食子儿茶素没食子酸酯共聚物(COS-EGCG)0.256 mg/mL能显著抑制单增李斯特菌的泳动和群集。本研究中，1 mg/mL和2 mg/mL的没食子酸能显著抑制溶藻弧菌的运动性，降低溶藻弧菌的聚集能力，且没食子酸溶液浓度越高，溶藻弧菌的运动性和聚集能力越低；同时，没食子酸能高效抑制生物被。生物被膜是由细菌分泌的胞外多聚物(EPS)组成，如蛋白质、胞外多糖、脂质和细胞外DNA，生物被膜有利于微生物黏附，能提高细菌对外界不良环境的抵抗能力，同时增加细菌对抗菌药物的抗性。多项研究指出，细菌的运动性和聚集能力在细菌早期粘附、生物被膜形成和细菌定殖过程中发挥着重要作用，细菌通过运动相互聚集，借助EPS粘附更多的游离菌，从而更加有利于生物被膜的形成，同时细菌间的聚集可促进其粘附，使生物被膜结构更加坚固。研究发现，多酚类物质能通过破坏细胞壁和细胞膜、减少生物被膜形成、干扰细菌运动和聚集能力等发挥对细菌的抑制效果。没食子酸可诱导大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物被膜特性发生不可逆变化。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和肉桂醛衍生物能抑制副溶血弧菌的运动能力和生物被膜形成。虾壳壳聚糖–表没食子儿茶素没食子酸酯共聚物(COS-EGCG)0.256 mg/mL能显著抑制单增李斯特菌的泳动和群集。本研究中，1 mg/mL和2 mg/mL的没食子酸能显著抑制溶藻弧菌的运动性，降低溶藻弧菌的聚集能力，且没食子酸溶液浓度越高，溶藻弧菌的运动性和聚集能力越低；同时，没食子酸能高效抑制生物被膜的形成，4 mg/mL和8 mg/mL浓度的没食子酸对溶藻弧菌生物被膜形成的抑制率可达77.80%和83.26%，对成熟溶藻弧菌生物被膜的清除率分别为67.54%和68.01%，表明没食子酸可能通过抑制溶藻弧菌的运动和聚集能力来抑制生物被膜的形成。生物被膜消除后，细菌对抗菌药物的抵抗力将显著下降，当没食子酸与抗生素联用时，可增加后者在大肠埃希氏菌菌体内累积而表现出抗生素增效剂作用。没食子酸也可通过破坏细胞膜完整性和调控ica基因家族而发挥抗菌作用，这种独特的抗菌机制几乎不会诱导细菌耐药性的产生。因此，没食子酸不仅可作为一种抗菌效果较好的药物添加剂使用，还可能作为一种抗菌增效剂联合抗生素进行疾病的治疗。
结论
没食子酸对溶藻弧菌的抑菌效果较好，可以通过破坏溶藻弧菌细胞壁，增加细胞膜通透性，抑制生物被膜的形成，清除成熟的生物被膜，通过抑制溶藻弧菌的运动和聚集能力抑制或杀灭溶藻弧菌，此研究结果将为水产动物弧菌感染性疾病的防治提供新的思路。
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