2结果
2.1显微镜观察结果
DHV-1 ZJ-08株在DEF-h细胞中培养24 h后，可以观察到CPE，72 h更明显，主要表现为细胞间隙增宽、拉网、脱落、细胞崩解和死亡等特征，而对照细胞的形态则表现良好的生长形态(图1)。
2.2 RT-PCR检测结果
采用RT-PCR方法检测经DEF-h细胞培养的第3代DHV-1的基因组。结果显示，扩增获得一条长约471 bp的特异性基因片段。该PCR产物的序列测定结果表明该序列与DHV ZJ-08株的基因序列同源性在99%以上。
2.3 IFA检测结果
DHV-1在DEF-h细胞中培养48 h后，经IFA检测结果显示，有大量特异性绿色荧光(图2)，表明DHV-1病毒蛋白获得了良好表达。
2.4 Western blot检测结果
采用western blot对感染DHV-1的DEF-h细胞进行免疫学检测，结果显示，在DEF-h细胞裂解物中能够检测到DHV-1 VP1的存在(分子量约26 ku)，而且能够与抗VP1的抗体特异性反应(图3)，表明表达产物具有良好的免疫原性。
图1 DHV-1病毒感染的DEF-h细胞(A-C)与正常DEF-h细胞(D)(400×)
图2 IFA检测DHV-1 VP1在DEF-h细胞中的表达(400×)
2.5鸡胚感染试验结果
将在DEF-h细胞中培养3代的DHV-1接种9日龄鸡胚，观察6 d。结果表明DEF-h细胞中增殖的DHV-1能够致死鸡胚(48 h～96 h)，死亡率为80%(12/15)，而用鸡胚分离的第5代病毒对鸡胚的致死率仅为40%，提示DHV-1更容易适应DEF-h细胞。
2.6 DHV-1在DEF细胞中的增殖规律
一步生长曲线表明DHV-1在DEF-h细胞中的增殖规律为：DHV-1感染DEF-h细胞后12 h开始增殖，36 h～72 h进入一个快速增殖期，84 h病毒滴度达到峰值，病毒滴度为4.54 TCID50/mL。96 h后，病毒的增殖随着细胞的崩溃而降低(图4)。
图3 Western blot检测DHV-1 VP1
图4 DHV-1在DEF-h细胞中的增殖规律
3讨论
目前，DHV的分离方法为采用SPF鸡胚或鸭胚分离，该方法虽然有效，但国内外研究均表明，DHV-1野毒株通常不易适应在鸭胚或鸡胚的增殖，往往需要盲传3代以上才能分离到病毒。因此，用禽胚直接分离DHV比较费时，而且SPF鸭胚的来源也十分有限，不能随时获得，使得用鸭胚分离DHV-1的方法受到很大限制。为此，本实验室构建了一种永生化的DEF-h细胞系，该细胞系对DHV-1十分敏感，为开展DHV-1的相关基础研究提供了良好的平台。
本研究在建立DEF细胞系的基础上，研究DHV-1在DEF-h细胞系中的增殖特性，为进一步研究DHV-1的致病机理和病毒与宿主之间的相互作用等奠定基础。本研究表明，DHV-1野毒(ZJ-08株)第一代就可以适应DEF-h细胞，而且产生明显的细胞病变(48 h)，72 h病毒滴度为4.3 TCID50/mL。在DEF-h细胞中连续增殖3代的DHV-1对鸡胚具有较强的致病性，致死率高于用鸡胚传代5次的DHV-1。表明用DEF-h细胞系分离DHV-1不仅比使用鸡胚或鸭胚分离病毒更便捷、易行，而且为开展DHV-1分子生物学研究提供良好的操作平台。
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