摘要
目的
探究甘胆口服液(Gan Dan oral liquid,GD)对副溶血弧菌的体外抑菌活性，并从转录组水平解析GD抗副溶血弧菌的分子机制。
方法
基于最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)和抑菌动态生长曲线，评价GD对副溶血弧菌的体外抑菌活性；通过扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)和透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)分析GD处理对副溶血弧菌细胞结构的影响；利用转录组测序及生物信息学技术分析1/4MIC浓度的GD处理对副溶血弧菌转录组的影响，并采用逆转录实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)进行验证。
结果
GD对副溶血弧菌具有较好体外抑菌活性，其MIC和MBC值分别为7.6 mg/mL和15.2 mg/mL。1/4MIC浓度的GD处理破坏了副溶血弧菌细胞壁结构完整性，影响了细胞膜的通透性，导致胞内大分子物质外漏。转录组分析结果表明，GD处理显著改变了副溶血弧菌的转录组，造成1 074个基因显著上调，以及1 179个基因显著下调。其中，下调基因主要富集在肌苷酸、核糖核苷合成代谢以及柠檬酸循环等通路，上调基因主要涉及转录因子活性、细胞壁合成代谢等通路。
结论
GD可能通过破坏菌体细胞壁和细胞膜结构的完整性，抑制细菌的能量代谢和生物合成等功能，进而对副溶血弧菌产生抑菌作用。
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性革兰氏阴性菌，广泛分布于海洋、河口，也常见于水产养殖环境中。该菌具有条件性致病的特性，在环境恶化、宿主机体免疫下降时可入侵水生动物，导致病害暴发。据报道，副溶血弧菌可感染鱼、虾、蟹、贝等数十种海水、淡水养殖动物，每年给水产养殖业造成数十亿美元的经济损失。副溶血弧菌也是一种食源性致病菌，人类误食该菌感染的水产品，可能出现呕吐、腹泻、腹痛等急性肠胃炎症状，严重时引发败血症，导致多器官衰竭甚至死亡。目前，抗生素仍是治疗水产动物副溶血弧菌感染的主要药物，但长期使用抗生素导致病原菌产生耐药性，并在水产品中留下药物残留等诸多问题。2019年，农业农村部等10部委联合发布了《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》，其中明确指出要开展水产养殖用药减量行动，开发绿色安全的抗生素替代产品。
中草药是中华民族的瑰宝，具有低毒副、低残留、不易产生耐药性等优点，已被用作抗生素的重要替代品，广泛应用于水产动物弧菌病的防治中。据报道，在饲料中添加500 mg/kg三黄散或0.6%青蒿素，可增强凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的免疫和抗氧化能力，并降低其在副溶血弧菌侵染后的死亡率。五倍子也被报道能抑制副溶血弧菌生长，其水提取物的体外最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)低于0.2 mg/mL，而且用20 mg/L的五倍子水提取物对副溶血弧菌感染的泥蟹(Scylla paramosain)进行药浴治疗，可有效降低泥蟹的死亡率。中药复方在病原菌方面往往优于单味中药的效果，在体外试验中，乌梅与石榴皮联用配伍对副溶血弧菌的MIC值为7.81 mg/mL，而乌梅、石榴皮单味药物的MIC值均为31.25 mg/mL；240 mg/mL的黄连、板蓝根、黄柏中药复方对河流弧菌(V.fluvialis)的抑菌作用强大，其效果优于单味中药的抑菌效果。目前，关于中草药抗副溶血弧菌的作用机制已进行一些探索。据报道，柠檬草精油、原茶儿酸、黄芩醇提物可能通过破坏副溶血弧菌细胞结构的完整性、干扰细胞能量代谢、抑制生物被膜形成等途径发挥抑菌作用。然而，现有研究仅从宏观角度初步分析了这些中药的抗菌机制，对于中草药抗弧菌的分子机制仍不清楚。
近年来，随着基因组学的飞速发展，高通量测序技术已被广泛应用于功能基因的挖掘、分子标记的筛选等研究。通过转录组测序技术，能够全面研究药物干预后菌体细胞内所有转录基因的表达变化，从而系统解析药物的作用机制。甘胆口服液(Gan Dan oral liquid,GD)是农业农村部批准的国家三类新兽药(兽用)，其主要成分包括甘草、板蓝根、人工牛黄、冰片等。程安达等研究发现，甘胆口服液对副溶血弧菌引起的对虾肝胰腺损伤有良好的修复作用，但GD对副溶血弧菌的作用机制尚不清楚。本研究通过抑菌活性、电镜观察等指标，明确GD对副溶血弧菌的抑菌作用，并利用转录组测序技术(RNA-Seq)分析GD对副溶血弧菌转录组的影响，解析其中关键的差异表达基因和通路，以期为副溶血弧菌防治提供理论基础。
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