白色念珠菌(Candida albicans),是一种重要的条件致病真菌,通常存在于鸽子的上消化道,一般在正常机体中数量少,不引起疾病,但当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群结构失调时会转变为致病菌,对鸽子造成危害,尤其是乳鸽感染的几率特别大。本病俗称鹅口疮,又称霉菌性口炎、念珠菌口炎、酸臭嗉囊病和念珠菌病,显著特征是病鸽食道和嗉囊的黏膜上产生黄白色的干酪样假膜,剥离假膜后可见糜烂和溃疡。当乳鸽感染白色念珠菌后,通常在下窝前一般无明显症状,下窝后症状明显,嗉囊会出现明显的干硬,精神沉郁,羽毛松乱,不愿走动,食欲减少甚至废绝,生长不良,消瘦,并且容易继发毛滴虫病、细菌感染,如文献报道,白色念珠菌尝尝继发或与金黄色葡萄球菌共感染,最终只能成为残次鸽。目前,在兽医临床,尚无有效的治疗药物针对白色念珠菌的感染或白色念珠菌造成的复合感染。


小檗碱,也叫黄连素,原是从中药川芍中提取的生物碱,目前可在多种草本植物中提取或人工合成,化学结构为四甲基吡嗪,已被证实具有多种生物学功能,包括抗炎、抗氧化、抗微生物、免疫调控、控制血糖、心血管保护等功能,临床上常常用于治疗腹泻、糖尿病及心血管等疾病,小檗碱对感染性腹泻的治疗具有较好的效果,临床上用药形式主要为盐酸小檗碱或硫酸小檗碱。同时,一些体外研究发现,小檗碱也具有一定的抗菌活性,其中对革兰氏阴性菌的抗菌活性较弱,最小抑菌浓度(MIC)在512-1024μg/mL范围,对革兰氏阳性菌的抗菌活性较强,最小抑菌浓度(MIC)通常在128-512μg/mL之间(夏帅,马立艳,谢苗荣.盐酸小檗碱对金黄色葡萄球菌体外抗菌活性的研究[J].临床和实验医学杂志,2022,21(07):673-678);此外,小檗碱对真菌感染也具有一定的治疗效果,如研究发现,小檗碱对白色念珠菌具有一定的活性,MIC一般在64-128μg/mL之间(雍江堰,王海,黄筱雪等.盐酸小檗碱与氟康唑联用对耐药白色念珠菌钙稳态的影响[J].中国病原生物学杂志,2020,15(08):903-909),对抗新生隐球菌活性的MIC范围在8-168μg/mL之间(徐佳龙,宋浩雷,陈晓琴等.小檗碱抗新生隐球菌活性和作用机制[J].微生物学报,2023,63(04):1541-1550.)。


SU3327(又称halicin、海立信,CAS No.:40045-50-9)是一种C-JUN的N末端激酶抑制剂,结构见图1。SU3327是一种有效的,选择性的且具有底物竞争性的JNK抑制剂,IC50为0.7μM。SU3327还以IC50值为239nM抑制JNK和JIP之间的蛋白相互作用。SU3327对p38α和Akt激酶的活性较低。先前的研究发现SU3327是一种潜在的抗糖尿病药物。另一文献已经报道,SU3327表现出一定的抗菌活性,对肠球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等临床常见病原菌具有一定的抗菌活性。

实验中所用小檗碱为小檗碱盐酸盐形式,即盐酸小檗碱,CAS号:633-65-8,分子式:C20H18ClNO4,分子量:372.82,购买于阿拉丁试剂公司,纯度≥98%。SU3327购买自美国MCE试剂公司,纯度≥99%。称取一定量的盐酸小檗碱配置成母液浓度为128mg/mL水溶液。SU3327使用DMSO配置成母液浓度为40mg/mL浓度的母液。所有母液制备好后储存在-20度冰箱。


下述实验中所用的病原菌:


耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 33591(MRSA33591)由国家兽药安全评价中心(北京)提供。


白色念珠菌标准指控菌ATCC12301购买于上海复祥生物科技公司。


下述实验中使用细菌培养基:


YPD培养基:先用电子天平称取20g葡萄糖、10g酵母提取物、20g胰化蛋白胨,再加入800mL去离子水,在磁力搅拌器上使固体完全溶解后,再用去离子水定容至1L,分装在锥形瓶内,若配制固体培养基,则按照需要加入2%的琼脂,并用高压灭菌锅进行120℃、30min灭菌后,放置常温备用。


MHB肉汤培养基购自北京陆桥技术股份有限公司,配制方法如下:称取25.0g于1L蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,121℃高压灭菌15min,备用。


液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)成分(g/L):胰蛋白胨15.0g/L,酵母粉5.0g/L,硫乙醇酸钠0.5g/L,葡萄糖5.0g/L,氯化钠2.5g/L,L-胱氨酸0.5g/L,刃天青0.001g/L,琼脂0.75g/L。


MHA培养基购自北京陆桥技术股份有限公司,配制方法如下:称取38.0g于1L蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,121℃高压灭菌15min,冷至55℃倾注平板备用。


脑心浸液培养基(BHI)购自北京陆桥技术股份有限公司,配制方法如下:称取本品38.5g,加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中,调节pH至7.3,121℃高压灭菌15分钟,备用。


BHI固体培养基购自北京路桥技术股份有限公司,配制方法如下:称取本品50.0g于1000mL蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,121℃高压灭菌20min,冷却至55℃倾注平板备用。


SU3327和小檗碱联合使用对白色念珠菌的协同抑制作用


SU3327和盐酸小檗碱联合使用对病原菌的联合用药指数(FICI)测定:使用棋盘法测定SU3327和盐酸小檗碱联合应用对白色念珠菌标准指控菌株ATCC12301菌株的FICI值。具体操作如下:使用棋盘肉汤稀释法测定不同药物之间的FICI。挑取真菌单菌落于沙氏葡萄糖肉汤中,在27℃培养真菌48h。用麦氏比浊仪调节真菌浊度至麦氏比浊度0.5,并用沙氏葡萄糖培养基稀释至1.0×103CFUs/mL后备用。在96孔U型板中加入100μL沙氏葡萄糖培养基,将相应浓度的药物加入第八行前10个孔中,依次向上倍比稀释至第二行。在第一列各孔加入其它待测药物,依次从左向右倍比稀释至第九列。1-10列均加入100μL稀释好的待测菌液。第11列和第12列分别为只含有沙氏葡萄糖培养基和含有待测菌液的阴性、阳性对照。将96孔板置于27℃静置培养24h后,读取结果,以肉眼能分辨的抑制真菌生长的最低药物浓度为该药物的MIC值。


FICI=MIC(A药联合)/MIC(A药单用)+MIC(B药联合)/MIC(B药单用),判断标准:FICI≤0.5,协同作用;0.5<FICI≤1,相加作用;1﹤FICI≤2,无关作用;FICI>2,拮抗作用。即:SU3327和小檗碱的FICI=MIC(小檗碱联合)/MIC(小檗碱单用)+MIC(SU3327联合)/MIC(SU3327单用)。

结果如下所示:


图2所示,SU3327和盐酸小檗碱单独使用对ATCC12301的MIC分别为40μg/mL和128μg/mL,按照棋盘法获得协同效果的最佳配比计算,SU3327和小檗碱的MIC分别降低至2.5μg/mL和16μg/mL(即SU3327和),协同指数FICI为0.1875,其中,按照棋盘法结果,SU3327与盐酸小檗碱质量比为(1.25-10):(2-16)的范围均具有协同作用,即相当于SU3327与盐酸小檗碱质量比为(1.25-10):(1.8-14.4),表明SU3327和小檗碱联合使用对白色念珠菌具有明显的协同抗菌活性。


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