1材料与方法


1.1材料


1.1.1植物和病原菌


桑枝:2022年秋采自重庆市蚕业科学技术研究院(29°48′58″N,106°24′51″E),桑树品种为抗性品种‘川桑7637’。


病原菌:S.sclerotiorum PZ-2为本实验室分离保存,Botryotinia fuckeliana、Colletotrichum gloeosporioides、Colletrichum lagenarium、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、旋孢腔菌(Cochiobolus sativus)、Thanatephorus cucumeri、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等为实验室收集保存菌株。


1.1.2培养基


LB培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母粉5.0,NaCl 10.0,琼脂15.0–20.0。


马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(g/L):马铃薯200.0,葡萄糖20.0,琼脂15.0–20.0。


PDB培养基(g/L):马铃薯200.0,葡萄糖20.0。


胰酪大豆胨琼脂(tryptone soya agar,TSA)培养基(g/L):胰蛋白胨15.0,大豆胨5.0,NaCl 5.0,琼脂15.0–20.0。


营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉膏3.0,NaCl 5.0,琼脂15.0–20.0。


R2A琼脂培养基(g/L):细菌蛋白胨0.5,可溶性淀粉0.5,酵母粉0.5,葡萄糖0.5,酸水解酪蛋白0.5,KH2PO4 0.3,丙酮酸钠0.3,MgSO4 0.024,琼脂15.0–20.0。


以上培养基均采用121℃灭菌20 min。


1.1.3主要试剂


KI-I2染液:60 mg/mL KI溶液与10 mg/mL I2溶液以体积比1:1混合。


200 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(4-hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid,HEPES)的配制:用1 mol/L NaOH溶液将1 mol/L HEPES溶液pH调至6.8–8.2,向20 mL 1 mol/L HEPES中加入80 mL水,得到200 mmol/L HEPES。


1.2桑树内生拮抗菌的分离及筛选


1.2.1内生菌分离纯化


利用植物组织培养法分离内生菌,具体方法:取健康的‘川桑7637’枝条,剪至5–6 cm长,置于75%乙醇中浸泡1–2 min,取出后于酒精灯火焰上燃尽表面乙醇,置于PDA培养基表面滚动数圈后28℃条件下培养,以验证表面灭菌是否彻底。随后用无菌刀片将其分三层,分别置于LB、TSA、NA、R2A培养基上28℃条件下培养,待植物组织周围长出菌落后,通过平板划线法分离纯化内生细菌。


1.2.2桑椹菌核病拮抗菌初筛


利用平板对峙法筛选对S.sclerotiorum PZ-2有拮抗效果的内生菌。用打孔器取直径8 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌饼,接种于培养基中央,在距中央2.5 cm处的4个方向分别划线接种不同内生菌,28℃培养,观察病原菌生长情况,筛选对S.sclerotiorum PZ-2具有拮抗效果的内生菌。


1.2.3桑椹菌核病拮抗菌复筛


对初筛拮抗效果较好的拮抗菌进行平板对峙法复筛。用打孔器取直径5 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌饼,接种于培养基中央,在距中央2 cm两侧对称处划线接种拮抗菌,以只接种病原菌的平板为对照,25℃培养4 d,测量与待测细菌划线垂直方向的病原真菌菌落直径,设置3个重复,并按公式(1)计算抑菌率。


抗菌率(%)=(对照组菌落直径-实验组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)*100   公式(1)


1.3桑椹菌核病拮抗菌的鉴定


1.3.1形态学及生理生化特征鉴定


利用平板划线法将筛选获得的拮抗菌接种于PDA和LB培养基上,37℃培养12 h,观察其菌落形态。在LB上培养24 h和48 h后,分别进行革兰氏染色和芽孢染色。生理生化特征检测采用新型微生物微量生化鉴定管试剂盒(广东环凯微生物科技有限公司)。


1.3.2基于16S rRNA基因序列的系统发育分析


提取目的菌株基因组,在1.5 mL离心管中加入30μL DNA提取液(PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent试剂盒)(Applied Biosystems公司),挑取适量菌落与DNA提取液混合均匀,100℃金属浴10 min,之后12 000 r/min离心3 min,取20μL上清液作为模板备用。


以目的菌株基因组为模板,利用16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′)扩增拮抗菌16S rRNA基因序列。PCR反应体系:上、下游引物(10μmol/L)各1μL,DNA模板1μL,2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL,ddH2O 9.5μL。PCR反应条件:95℃3 min;95℃15 s,55℃15 s,72℃30 s,30个循环。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,将获得的基因序列在NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行比对,并利用MEGA 5.0软件基于16S rRNA基因序列构建系统发育树。


1.4拮抗菌抑菌谱测定


以实验室保存的常见植物病原菌为靶标菌,用打孔器取直径为5 mm的菌饼,接种于培养基中央,在距离中央2 cm处左右两侧接种拮抗菌,每个处理设置3个重复,25℃培养,参照公式(1)计算抑菌率。


1.5拮抗菌对桑椹菌核病的离体防效实验


微调后进行离体防效实验。


1.5.1菌悬液及发酵上清液制备


挑取拮抗菌单菌落接种于10 mL LB液体培养基中,37℃、180 r/min培养过夜,将种子液接种至100 mL LB液体培养基,37℃、180 r/min培养过夜后,将发酵液12 000 r/min离心3 min收集菌体,用无菌水重悬到OD600为0.6(108 CFU/mL)制成菌悬液。


将拮抗菌接种到LB液体培养基,37℃、180 r/min振荡培养4 d,取发酵液12 000 r/min离心30 min后,上清液过0.22μm滤膜,获得无菌发酵上清液。


1.5.2离体防效实验


将新鲜桑椹置于75%乙醇浸泡20–30 s,无菌水洗去乙醇,无菌滤纸吸干水分;无菌针头刺破桑椹后分别在纯水、LB液体培养基、拮抗菌菌悬液、拮抗菌发酵上清液、甲基硫菌灵(稀释750倍)中浸泡30 min,取出置于培养皿自然晾干,取3块直径为8 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌饼接种在桑椹上针头刺破处,保鲜膜包裹后放入组培瓶,室温(15–20℃)静置培养。每个处理设置5个生物学重复,每个生物学重复包含5个桑椹。室温培养2 d后取下保鲜膜,去除菌饼,观察记录并按公式(2)计算病情指数,菌悬液处理组和甲基硫菌灵以纯水为对照,发酵上清液处理组以LB液体培养基为对照,均按公式(3)计算防效。


根据处理后桑椹发病时的表面菌丝覆盖率,将发病桑椹进行分级:0级,无发病桑椹;1级,桑椹表面菌丝覆盖率0%–25%;2级,桑椹表面菌丝覆盖率25%–50%;3级,桑椹表面菌丝覆盖率50%–75%;4级,桑椹表面菌丝覆盖率75%–100%。


1.6拮抗菌抑菌机理初探


1.6.1拮抗菌发酵上清液对病原菌菌丝生长抑制作用


将拮抗菌接种到PDB培养基中,37℃、180 r/min培养4 d后,取发酵液12 000 r/min离心30 min,随后上清液过0.22μm滤膜,获得无菌发酵上清液。


利用菌丝生长速率法测定拮抗菌无菌发酵上清液对桑椹菌核病原菌S.sclerotiorum PZ-2的抑制效果。将病原菌S.sclerotiorum PZ-2分别接种至含有50%、20%、10%、5%、3%和2%拮抗菌无菌发酵上清液的PDA平板,25℃培养48 h,以未添加无菌发酵上清液的PDA平板为对照,参照公式(1)计算抑菌率,并在显微镜下观察S.sclerotiorum PZ-2菌丝形态。


1.6.2拮抗菌对病原菌糖原积累的影响


通过糖原染色测定拮抗菌对病原菌糖原积累的影响。在铺有玻璃纸的PDA平板中央接种直径5 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌饼,距中心2 cm处两侧接种拮抗菌,取25℃对峙培养1、2、3、5 d后的S.sclerotiorum PZ-2菌丝置于载玻片上,用KI-I2染液染色1 min后盖上盖玻片,置于显微镜下观察,颜色越深代表菌丝糖原含量越多。以在PDA平板上培养相同时间的S.sclerotiorum PZ-2作为对照。


1.6.3拮抗菌对病原菌胞内活性氧的影响


采用DCFH-DA活性氧荧光探针测定对峙培养1、2、3、5 d的S.sclerotiorum PZ-2菌丝内活性氧含量。将S.sclerotiorum PZ-2菌丝置于200 mmol/L HEPES缓冲液中静置浸润20 min后,转移至15μmol/L的DCFH-DA溶液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司),25℃黑暗标记1 h,制片,置于荧光显微镜下观察,激发波长495 nm,发射波长515 nm。


1.6.4拮抗菌对病原菌基因表达的影响


根据1.6.1、1.6.2和1.6.3实验结果,利用实时荧光定量PCR检测拮抗菌对S.sclerotiorum PZ-2基因组中糖代谢、抗氧化酶和细胞壁成分相关基因表达情况的影响。


按1.6.2方法收集病原菌菌丝,依据Omega Fungal RNA Kit R6840(Omega Bio-Tek公司)说明书提取S.sclerotiorum PZ-2菌丝总RNA。


利用一步反转试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将RNA反转为cDNA。反转体系:5×All-in-one qRT SuperMix 4μL,Enzyme Mix 1μL,RNA template 1μg,RNase-free ddH2O补足20μL。反应程序:50℃15 min;85℃5 s。


参考NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中S.sclerotiorum基因组选取与糖代谢有关的基因Gene_9536(己糖激酶)、Gene_3455(糖基转移酶家族20)、Gene_7772(葡萄糖磷酸变位酶),与病原菌抗氧化相关的基因Gene_5305(过氧化氢酶相关的免疫反应性)、Gene_4935(过氧化氢酶)、Gene_1287(过氧化物酶体),与细胞壁组分合成相关的基因Gene_13(糖基转移酶、纤维素酶)、Gene_11361(几丁质合成酶2)、Gene_622(细胞壁)。利用软件Primer 5设计以上基因引物,内参基因和各基因的引物序列如表1所示。

表1.实时荧光定量PCR检测病原菌基因表达的引物序列


实时荧光定量PCR:每个样品设置3个生物学重复,每个生物学重复含3次技术重复。反应体系:TB Green Premix Ex Taq II(2×)10µL,正、反向引物(10µmol/L)各0.8µL,cDNA模板5µL,RNase-free ddH2O 3.4µL。反应程序:95℃30 s;95℃10 s,40个循环;60℃30 s。


1.7数据统计及分析


数据均采用Excel 2018进行分析计算,利用GraphPad Prism 8中t检验对相对基因表达量进行显著性分析并作图。


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