研究简介
西藏开菲尔粒（Tibetan kefir grains,TKGs）是一种传统的发酵乳制品，含有复杂的微生物群落，被认为具有多种益生健康功效。然而，其复杂的菌群结构限制了大规模应用和新抗菌物质的发现。本研究旨在深入分析一种来自西藏牧民自制开菲尔粒（TKG-Y）的微生物组成，并从中筛选、鉴定具有抗菌潜力和发酵能力的特定菌株，为其后续应用研究提供基础。研究人员以西藏牧民自制藏传克菲尔粒TKG-Y为对象，首次系统解析其宏观形态、微观结构及微生物组成，发现乳酸菌科占细菌73.76%，酵母菌科占真菌91.87%，功能基因富集于碳水化合物代谢与膜转运，无耐药通路，安全性良好。
通过高通量筛选，从中分离到一株能产细菌素样抑制物（BLIS）的Staphylococcus warneri KYS-164；其BLIS对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等具显著抑菌作用，基因簇以warnericin为核心。连续传代80代后，菌株无耐药突变，BLIS活性保持，仅携带低毒力基因eta与eno，且eno在传代中丢失。体外胃肠模拟显示，胃酸及胃蛋白酶使活菌数下降2.5 log，BLIS活性降低21%，但进入小肠后菌量回升，具备存活潜力。GC-IMS风味分析表明，KYS-164单菌发酵牛奶2 d即可生成醛、酯、醇、酮等84种挥发性物质，赋予乳品花香、果香、奶香及坚果香，其风味浓度与多样性优于同期TKG-Y混菌发酵。研究首次阐明藏传克菲尔粒中S.warneri的抑菌、传代稳定性与增香能力，为开发兼具生物防腐与风味调控功能的直投式发酵剂提供理论与菌株基础。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C自动生长曲线分析仪在本研究中被用于精确、高效地监测微生物的生长动力学。将目标病原菌（金黄色葡萄球菌CICC 10384和大肠杆菌154-c）培养至指数生长期（OD₆₀₀=0.4）。将KYS-164菌株活化后，以1%的接种量接入无菌MRS液体培养基中，以观察其自身生长情况。将上述病原菌（单独或按1:1体积混合）与不同浓度的BLIS（1×MIC和4×MIC）混合。将甘油保存的病原菌菌液直接以0.2%的接种量加入LB液体培养基，并立即与1×MIC的BLIS混合。上述所有混合液分别加入100孔板中。将孔板放入Bioscreen C分析仪内，在特定温度下进行培养。监测S.warneri KYS-164自身在MRS中的生长曲线。实时记录未活化/活化后的病原菌（大肠杆菌366-a、金黄色葡萄球菌CICC 10384及其混合菌）在1×或4×MIC的BLIS作用下的吸光度变化，绘制抑菌-杀菌曲线。比较添加与未添加BLIS的病原菌在100孔板中每小时600 nm自动读数，量化BLIS对延滞期、生长速率及最终菌量的影响。
实验结果
研究首次系统解析了来自西藏的自制开菲尔粒TKG-Y的微观结构和微生物群落。细菌群落以乳杆菌科（Lactobacillaceae）为主（73.76%），真菌群落以酵母菌科（Saccharomycetaceae）为主（91.87%）。扫描电镜（SEM）观察显示，TKG-Y具有典型的多孔网状结构，酵母菌主要分布在颗粒外层。功能预测显示其微生物群落代谢活跃，且与人类疾病相关的基因通路较少，暗示了TKG-Y具有较好的生物安全性成功从TKG-Y中分离出一株具有重要应用潜力的菌株。菌株KYS-164能够产生类细菌素抑制物质（BLIS），该物质在低浓度下即可有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等食源性致病菌的生长。全基因组测序发现KYS-164携带以warnericin为中心的基因簇，这解释了其BLIS的抗菌特性。
尽管胃酸和蛋白酶会部分影响其活性，但体外模拟胃肠消化实验证明KYS-164及其产生的BLIS具有一定的耐受性。更重要的是，经过80代传代培养，菌株未产生抗生素耐药性，且其BLIS的抗菌活性在40代后依然稳定。本研究从西藏开菲尔粒中发掘并系统表征了一株具有双重功能的菌株——沃氏葡萄球菌（S.warneri）KYS-164。该菌株不仅能产生稳定、安全的抗菌物质（BLIS），具备作为天然生物防腐剂的潜力；同时还具有优良的乳品发酵能力，能赋予产品丰富的风味。
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