2.7温度、pH及溶氧与菌株生长的关系


2.7.1温度Act0988菌株不同温度培养96 h(图8)显示,在16℃-28℃培养,生物量随培养温度的升高而增大,28℃培养的生物量达6.0 mg/mL,高于28℃生物量则随温度的升高而明显降低。菌株25℃与31℃培养的生物量分别为86.26%和89.55%,且在37℃下仍可生长。结果表明,Act0988系一中温型菌株,且生长适宜的温度范围较大,较耐高温。


2.7.2 pH不同初始pH培养Act0988菌株的生物量(图9)显示,菌株经pH7处理的生长最好,生物量为6.2 mg/mL,与其他处理间的差异显著(P>0.05)。其次,pH=6、8处理发酵液生物量分别为5.6 mg/mL和5.7 mg/mL。其余5个pH培养基发酵液的生物量显著低于前3个pH处理的发酵液的生物量。结果表明,菌株生长适宜中性及弱酸、弱碱条件。

图8温度与菌株生长的关系

图9培养基初始pH与菌株生长的关系


2.7.3装液量Act0988菌株在不同装液量的三角瓶内培养96 h的生物量(图10)显示,装液量为40 mL和60 mL处理的生长最佳,生物量分别为6.1 mg/mL和6.3 mg/mL,两者间差异不显著,且都显著高于其他装液量处理的生物量;装量为120 mL和140 mL菌株的生长最差,生物量仅为4.3 mg/mL和4.0 mg/mL。结果表明,菌株生长对溶氧的需求量较大。


3讨论


Act0988菌株在葡萄糖培养基内生物量显著低于其他碳源的生物量,可能是因菌株的生长过快,培养基中溶氧不足、发酵液pH较低。菌株甲基红实验为阳性,表明菌株将代谢产生的有机酸转化为中性物质的能力较差,当培养基溶氧不足时pH值易降低,不利菌株生长。菌株可溶性淀粉培养基的生物量最大,结果与唐婧媛等[15]对海洋放线菌发酵条件优化的研究结果相近,淀粉为迟效碳源,可溶性淀粉培养微生物的生长相对较慢,即使溶氧相对较低时发酵液pH不至过低而抑制菌株的生长。另外,工业发酵生产微生物次生代谢产物,以葡萄糖为碳源多因分解代谢阻遏致使目的产物的产量较低[16],以多糖为碳源次生代谢产物的产量较高,故开发Act0988菌株产抗菌物质时发酵培养基碳源筛选应以淀粉为重点。

图10装液量与菌株生长的关系


本研究供试氮源包括有机和无机氮源两类。Act0988菌株在生化试剂类有机氮源的生长较好,而无机含氮化合物的生长较差,与孟庆方等[17]对拮抗链霉菌发酵条件的研究结果相似。生化试剂有机氮源中含丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸,以及糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子,可以满足大多数微生物生长的营养需求,因而Act0988菌株在生化试剂有机氮源培养基的生长较好。无机氮源的成分单一,几乎仅为微生物提供氮素营养,氮素利用后残余离子与机团可能影响微生物的生长。供试4种无机氮源培养基Act0988菌株生物量差异较大的结果与无机氮源的性质相关,KNO3与NaNO3的氮素被菌株利用后可使发酵液的pH值升高,有利于菌株的生长;相反,(NH4)2SO4中的氮素被菌株利用后残余的使发酵液的pH降低,对菌株的生长不利。发酵生产微生物代谢产物培养基的氮源主要以大豆饼粉、花生饼粉等为原料,但有机氮源微生物利用较慢,而对无机氮利用快。后续研发菌株产抗菌物质的过程中,筛选发酵培养基时适量添加KNO3与NaNO3,对缩短接种后的延滞期及避免对数期发酵液pH的大幅下降都有一定的作用。


培养基pH对微生物的生长的影响很大[18]。Act0988菌株在pH6-8内的生长较好,其中pH为7的生长生物量最大,与大多数放线菌一致[19]。微生物生长适宜的pH范围与次生代谢产物产生pH范围可能各异。开发菌株目的产物时,前期应提供菌株生产最适的pH值,对数期后则要提供产物合成最适的pH,这有待进一步研究发酵pH的调控技术。


好氧微生物生长对数期的需氧量最大,振荡培养中装液量是影响三角瓶发酵液溶氧的主要因素之一,在特定转速下,装液量直接影响培养基中的溶氧量。Act0988菌株在装60 mL培养基的500 mL三角瓶内的生物量最大,与相关微生物产生次生代谢发酵工艺研究的最适装液量基本一致[20-22],而本研究仅为装液量与菌株生长的关系。发酵过程中需氧最大的是对数期,而次生代谢产物合成的时期为平稳期,此期间的需氧较对数期的需氧量低。


本研究表明Act0988拮抗菌株为多产色链霉菌,菌株产抗菌物质的吸收光谱与多烯大环内酯类广谱抗真菌抗生素吻合。迄今关于多产色链霉菌的研究,国内仅有廉立慧等[23]分离获得对黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌拮抗作用的多产色链霉菌菌株及袁林等[24]获得对金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌、黑曲霉具拮抗作用的GX-21菌株的报道,国外仅见Kim等[25]对多产色链霉菌产胆固醇氧化酶研究的报道。抗生素为微生物次生代谢产物,工业生产微生物次生代谢产物中的工艺调控可分为平稳期前的生长期和平稳期中的产物合成期两个重要阶段。生长期的重点是创造良好培养条件,确保微生物生长速度快、生物量大,以提高设备的利用率、并有足够的菌量为后期目的产物的累积奠定基础;产物合成期的重点是防止微生物过早衰亡,从而获得更多的目的产物的产量,提高生产效率。两个阶段的目的不同,实现两个阶段目的的条件常不一致。本研究报道对多产色链霉菌Act0988拮抗菌株培养条件与菌株生长的关系不仅丰富了多产色链霉菌的研究内容,而且为后续开发菌株产抗菌物质中实现菌种培养前期的快速生长、确保生物量奠定一定基础,但对于延长产物合成累积的平稳期的调控技术有待进一步研究。后续再进一步进行Act0988拮抗菌株高产菌株的选育、发酵培养基的系统筛选与优化、发酵调控技术等的研究后,成功开发适用于多种水果采后贮藏防腐的菌株产抗菌物质的潜力极大。


4结论


经生理生化与分子生物学鉴定结表明Act0988拮抗菌株为多产色链霉菌菌株。Act0988野生型菌株以玉米淀粉、豆饼粉及少量酵母膏制备的培养基培养144 h,发酵液对青霉菌的平板抑菌圈直径为18.4 mm,菌株适宜生长温度25-31℃。研究表明Act0988菌株易培养、发酵液抗菌活性强。


Act0988放线菌拮抗菌株的鉴定、培养条件与菌株生长关系、发酵工艺(一)

Act0988放线菌拮抗菌株的鉴定、培养条件与菌株生长关系、发酵工艺(二)

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