保护性微环境的产生
与浮游状态相比，生物膜内的微生物对抗菌药物表现出更高的耐药性。这种现象通常与抗菌药物渗透性差（由于胞外基质的存在）、适应性应激反应的激活（包括持留菌的产生和群体感应机制的诱导）以及生物膜种群内的生理异质性有关。然而，空间异质性环境和空间复杂的细胞-基质排列在生物膜内细菌抗菌药物耐药性中的重要性受到的关注有限。
图8 胞外多糖-微菌落复合体对氯己定（CHX）的局部保护作用。
(A) 暴露于0.12% CHX 15分钟后，混合菌种生物膜内细菌细胞活力的代表性共聚焦图像。活细胞显示为绿色（SYTO 9），死细胞显示为红色（碘化丙啶）。图像显示了：(1) 胞外多糖-微菌落复合体内部的细胞，(2) 此类结构外部的细胞，以及(3) 由ΔgtfBC突变株形成的生物膜（缺乏胞外多糖-微菌落复合体）。比例尺=50 μm。(B) 在CHX暴露过程中，不同细胞群体的存活率随时间的变化。数据为平均值±标准差（n=5）。实心圆圈：胞外多糖-微菌落复合体内部的细胞；空心圆圈：胞外多糖-微菌落复合体外部的细胞；实心三角形：ΔgtfBC突变株生物膜中的细胞。星号(*)表示在指定时间点，胞外多糖-微菌落复合体内部细胞的存活率显著高于其他两组（P<0.05）。
被富含胞外多糖的基质包裹和包围的细菌小岛的构建可以在生物膜内产生局部的微生物抗菌药物耐药性区域。因此，我们评估了同一完整生物膜系统内两组不同的细菌细胞在暴露于氯己定的即时局部效应下的活力（通过延时测量）。我们检查了（1）胞外多糖-微菌落复合体内的细胞，和（2）此类结构之外（或未形成此类结构）的细胞（图8）。CHX是一种广谱抗菌剂，常用于漱口水（浓度为0.12-0.2%），以抑制口腔中变形链球菌的水平。暴露于0.12% CHX后活细胞（绿色）和死细胞（红色）的重叠图像显示在图8A中。显然，胞外多糖包裹的微菌落内部（图8A-1）比这些结构化群落外部的细胞（图8A-2）随时间推移含有更高比例的活细胞。
还使用共聚焦图像计算了每组细菌细胞的存活率（图8B）。数据显示，在暴露15分钟后，胞外多糖-微菌落复合体内只有不到10%的总细胞被杀死。相比之下，结构外超过70%的细胞不可存活（P<0.05）。在缺乏基质的情况下，细胞对CHX高度敏感。用 gtfBC 无效突变株形成的混合菌种生物膜被CHX迅速杀死（图8A-3；图8B）。类似地，通常不组织成胞外多糖-微菌落复合体的细菌细胞，例如在1%葡萄糖中生长的生物膜中的细胞，也高度易被CHX杀死（暴露于CHX 15分钟后，60-75%的细胞死亡；数据未显示）。
氯己定是一种阳离子双胍。带负电的胞外多糖（可能由于与脂磷壁酸的关联）的存在可能会延缓带正电的CHX分子进入生物膜的扩散。然而，我们的数据显示，抗菌药物耐药性并非仅仅与胞外多糖的物理存在相关的一般属性，而是与基质与细菌细胞的组装方式有关，这种方式可能限制了CHX进入胞外多糖-微菌落结构。
此外，聚集在胞外多糖-微菌落复合体内的细胞可能会响应细胞密度和/或这些细菌小岛中酸性微环境的存在而产生直接的抗菌药物耐药性。这些观察结果支持了抗菌药物耐药性是更大生物膜结构内一个位点特异性属性的概念，尽管我们无法探索上述其他可能性。
最近一项研究的结果证明了结构化环境（使用微流控装置内的制造互联腔室）通过创建陡峭的化学梯度对于细菌抗生素耐药性快速进化的重要性。我们的发现与Zhang等人的模型一致，在我们的实际生物膜系统中重现了空间异质性。简而言之，胞外多糖基质创造了高度分隔但又相互连接和内聚的微环境。结果，局部产生了酸性区域和抗菌药物耐药性龛位，展示了三维结构在毒性口腔生物膜进化中的重要性。
结论
在这项研究中，我们表明，在蔗糖存在下，变形链球菌来源的GtfB和GtfC的协同作用在sHA表面形成了一层异质性的胞外多糖层。表面形成的胞外多糖促进了细菌的局部积累。原位持续的胞外多糖产生包裹了微生物，它们迅速聚集，形成密集堆积的细菌小岛（称为胞外多糖-微菌落复合体）。随着时间的推移，这些三维结构通过周围的胞外多糖变得相互连接。胞外多糖在sHA和细菌表面的顺序积累组装了一个错综复杂的复杂三维基质，导致在一个完整的混合菌种生物膜内形成了高度分隔的结构。
我们新颖的pH作图方法揭示了基质三维结构在生物膜毒力中的相关性，该方法使用了直接掺入基质的pH标记物。我们展示了空间异质性的pH微环境，表现为仅在胞外多糖包裹的细菌小岛内部发现的“酸性口袋”，尽管暴露于中性缓冲液。这一观察结果在口腔环境的背景下具有临床意义，因为在口腔中，中性pH的唾液非常丰富。低pH龛位有利于耐酸微生物，确保持续的局部产酸；富含胞外多糖的环境促进了结合葡聚糖的病原体变形链球菌的积累。与基质结构相关的环境变化将微生物平衡从无毒力状态转变为有毒力状态。此外，仅在sHA表面上存在表面附着的胞外多糖包裹的微菌落的区域发现了酸性pH（<5.5）区域。磷灰石表面存在高浓度的酸有利于局部脱矿（同时阻止再矿化），从而促进这些部位龋损的发展。此外，遍布生物膜结构的胞外多糖-微菌落复合体内的细菌细胞受到局部保护，免受强效抗菌剂CHX的侵害。
我们证明了变形链球菌并不总是需要在菌斑中占据主导地位才能影响毒力，因为即使在生物膜起始时释放的Gtfs也能粘附到获得性膜和其他微生物上，介导富含胞外多糖基质的构建。此外，GtfB和GtfC的表达在其他口腔细菌存在时会增强。先前的研究结果已将Gtfs与生物膜形成（在单菌种生物膜中使用标准遗传学和/或简单细胞染色试验）和毒力表达（使用啮齿动物模型）联系起来。我们的数据阐明了GtfB和GtfC衍生的胞外多糖在生物膜基本生物学中的功能作用。我们展示了三维胞外多糖基质结构的组装如何帮助创造空间异质性，并促进混合菌种生物膜内各种结构化酸性微环境的形成。显然，我们研究的数据为进一步阐明细胞-基质相互作用如何控制对口腔生物膜毒力表达至关重要的生态和环境龛位的创造提供了新的途径。
这里产生的信息可能为设计未来的研究铺平道路，旨在开发更好地预防和/或促进破坏毒性牙菌斑的新方法。此外，我们引入了研究完整三维结构内生物膜构建和异质性的新方法。我们的观察结果具有超越口腔的广泛适用性，因为所引入的成像技术可以适用于其他生物膜系统，在这些系统中，聚合物在基质发育过程中形成，并产生多样的微环境。
致谢
作者感谢Karl A. Kasischke博士在生物膜共聚焦荧光成像期间提供的技术援助。我们感谢佛罗里达大学口腔生物学系的Robert A. Burne博士提供本研究中使用的突变株。我们还衷心感谢William H. Bowen博士提供变聚糖酶，在本研究过程中进行有益的讨论，并对稿件进行批判性审阅。
作者贡献
构思和设计实验：JX HK。执行实验：JX MIK CMD BL MLF。分析数据：JX MIK HK CMD BL MLF AH JRYIII。贡献试剂/材料/分析工具：HK JRYIII AH。撰写论文：JX MIK MLF HK。开发DUOSTAT并更新COMSTAT：AH。