变形链球菌胞外多糖相关基因和蛋白表达的动力学
变形链球菌的胞外多糖生物合成机制（由蔗糖触发）会随时间受到环境条件变化和生物膜群落中其他成员的影响。我们探讨了引入1%（w/v）蔗糖如何在混合菌种生物膜形成和成熟过程中影响变形链球菌中胞外多糖相关基因和蛋白的表达。变形链球菌产生三种葡萄糖基转移酶（由 gtfB, gtfC 和 gtfD 编码）和一种内切葡聚糖酶（dexA），它们参与葡聚糖的合成和降解。此外，一种果糖基转移酶和一种果聚糖水解酶（分别为 ftf 和 fruA）催化主要由 β-2,1 键连接的果聚糖的合成和分解。
图2. 混合物种生物膜形成过程中变形链球菌EPS相关基因及蛋白质的表达。(A)本图展示了在引入1%（w/v）蔗糖后的特定时间点，变形链球菌在混合物种生物膜中gtfB、gtfC、gtfD、fruA、ftf和dexA基因表达的RT-qPCR分析结果。所示数据为平均值±6个标准差（n = 12）。星号（*）表示gtfB、gtfC（在67小时时）的表达水平与其他时间点存在显著差异（P < 0.05，Tukey-Krammer HSD）。(B)本图展示了在引入1%（w/v）蔗糖后67小时，变形链球菌在单一或混合物种生物膜中gtfB、gtfC和dexA基因表达的RT-qPCR分析结果。所示数据为平均值±6个标准差（n = 12）。特定变形链球菌基因在单一和混合物种生物膜之间的表达水平存在显著差异（P < 0.05）。(C)本图包含MudPIT分析，用于检测在引入1%（w/v）蔗糖后的特定时间点，变形链球菌在混合物种生物膜中EPS相关蛋白质的表达情况（n = 2）。使用光谱计数对每个测试时间点的蛋白质进行定量；蛋白质数据的标准差未在表中显示。(D)本图展示了在引入1%（w/v）蔗糖后67小时，变形链球菌在单一或混合物种生物膜中GtfB、GtfC和DexA丰度的MudPIT分析结果（n = 2）。采用光谱计数对每个测试时间点的蛋白质进行定量；蛋白质数据的标准差未在表中列出。
变形链球菌 gtfBCD, dexA, ftf 和 fruA 基因及其产物的表达谱如图2所示。数据显示，与其它时间点（如91和115小时）相比，gtfB, gtfC 和 dexA 的表达在43至67小时之间（从初始细胞积累到sHA表面胞外多糖-微菌落发展的过渡期）被显著诱导（图2A）。MudPIT分析表明，GtfB和GtfC的丰度（即光谱计数）在67小时时在生物膜内升高（图2C），表明与较晚的时间点（115小时）相比，这些蛋白的比例更高。这些胞外酶在生物膜发育早期的诱导与富含胞外多糖基质的组装高度相关。分泌的Gtfs结合到sHA和细菌表面，当结合时显示出增强的酶活性。表面吸附的GtfB和GtfC酶就地产生大量的葡聚糖，变形链球菌可以大量结合其上。结果，它促进了胞外多糖和细菌细胞的局部积累。
自然界中的生物膜，如牙菌斑，通常由混合菌种组成。生物膜内一个物种对同一生物膜内另一个物种基因表达的影响尚未得到充分探索。我们研究了在单菌种与混合菌种生物膜中生长的变形链球菌细胞中 gtfB, gtfC 和 dexA 的表达情况（引入1%蔗糖后）。与单菌种生物膜中观察到的相比，混合菌种生物膜中变形链球菌 gtfB 和 gtfC 的表达，以及在较小程度上 dexA 的表达，均有升高（P<0.05；图2B和2D），这导致了环境中相应蛋白量的增加。很可能 gtfB 和 gtfC 是在其他口腔物种存在下由自诱导分子（如AI-2）诱导的。由LuxS系统（与AI-2合成相关）介导的种间信号已被证明可以通过增强 gtfB 和 gtfC 的表达来调节变形链球菌生物膜的形成，但不影响 gtfD 基因。这一观察结果与我们的基因/蛋白表达数据一致。变形链球菌 luxS 突变体的生物膜形成缺陷可以在体外由几种细菌产生的AI-2互补，但不能由口腔链球菌ATCC 10557互补（这是一个不同的菌株，并非我们在本研究中使用的ATCC 35037）。基于AI-2的信号如何在混合菌种生物膜中上调变形链球菌Gtfs的确切机制尚未完全阐明。这些共生菌是否会释放额外的信号分子来抑制变形链球菌中 gtfs 的表达仍有待确定。
值得注意的是，gtfBC 转录本反应的幅度大于相应蛋白丰度的预期增加。这种明显的差异可能是由于蛋白质检测技术和mRNA转录本检测技术的灵敏度不同造成的。此外，可能存在转录后调控，通过基因特异性的翻译控制来改变蛋白质水平，或者影响mRNA稳定性和降解之间的平衡。
与基质组装有关的分子机制尚不清楚，因为关于混合菌种生物膜内胞外多糖的调控和时间性产生的基本知识仍然缺乏。我们表明，gtfB 和 gtfC 的表达在生物膜发育的早期阶段以及在其他微生物存在时得到增强。这些胞外酶合成的胞外多糖可能对基质的顺序构建和结构有直接影响。
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