结果
携带多个质粒编码rovM拷贝的鼠疫耶尔森菌菌株响应营养线索显示差异化的生物膜形成RovM在大肠杆菌（LrhA）和菊欧文氏菌（PecT）中的同源物已被暗示参与调节聚集和生物膜产生所需的基因。与在多拷贝质粒上克隆的rovM同源物相关的过表达与异常表型有关，而野生型和突变株表现出相同的表型，例如，在低拷贝数质粒上过表达lrhA导致大肠杆菌运动性丧失，而ΔlrhA突变体和野生型仍保持运动性。
因此，评估了ΔrovM突变株在聚苯乙烯微孔板上成功产生生物膜的能力，与野生型、以及转化了携带rovM基因的质粒的野生型和ΔrovM突变株（野生型（pCR_rovM）、ΔrovM（pACrovM）和ΔrovM（pCR_rovM））进行比较。ΔrovM突变体在LB（4mM MgCl2，4mM CaCl2）培养基中产生的附着生物膜量与携带高或低拷贝数空质粒的野生型菌株相似。有趣的是，转化了pCR_rovM或pACrovM的野生型和ΔrovM菌株，即它们含有多个rovM基因拷贝，似乎产生同样减少的生物膜，但这归因于较少的附着生物膜容易被洗掉。在LB培养基和TMH培养基（补充0.2%半乳糖）中的生长分析表明，野生型（pCR_rovM）、ΔrovM（pCR_rovM）和ΔrovM（pACrovM）的生长速率显著快于野生型和rovM突变体。
当在TMH-gal+培养基中培养时，野生型（pCR_rovM）和ΔrovM（pACrovM）菌株产生的生物膜量相对于携带空质粒的野生型和ΔrovM突变株要多。不同的是，在TMH-gal+培养基中，观察到较少的附着生物膜并不是造成这种差异的原因。
ΔrovM突变体在跳蚤体内具有竞争适应性劣势
昆虫病原体发光光杆菌和嗜线虫致病杆菌的RovM同源物LrhA和HexA，在感染各自昆虫宿主期间调节毒力因子表达、免疫抑制和代谢利用。我们观察到在不同营养环境中过表达rovM的菌株存在差异化的生物膜形成。因此我们预测，如果鼠疫耶尔森菌的RovM在跳蚤感染期间保持类似作用，那么其缺失可能会影响生长、存活和/或生物膜介导的肠道阻塞。
因此，评估了鼠疫耶尔森菌ΔrovM突变株成功感染跳蚤并产生生物膜阻塞的能力。在跳蚤感染期间，野生型、ΔrovM突变体和互补突变体ΔrovM（pACrovM）菌株表现出可比较的生物膜阻塞、感染率、每只跳蚤的平均细菌负荷和跳蚤死亡率（数据未显示）。
如果鼠疫耶尔森菌缺失了一个对其在跳蚤肠道适应很重要的基因产物，其竞争相互作用可能导致适应性缺陷，从而影响感染。因此，为了研究RovM突变是否带来任何潜在的不利条件，进行了该突变体与其同基因野生型菌株的竞争性共感染。用野生型和ΔrovM突变体或ΔrovM（pACrovM）菌株以1:1的比例共感染一组跳蚤。
在与野生型共感染期间，尽管在感染后第0天ΔrovM突变体的感染负荷显著增加，但在感染后第28天观察到ΔrovM突变体跳蚤感染负荷显著下降。相反，在与野生型菌株共感染期间，ΔrovM pACrovM菌株在28天共感染时显示出显著增加的感染负荷。
RovM响应营养物质调节生长
嗜线虫致病杆菌的LrhA突变体表现出代谢缺陷，影响其感染昆虫宿主的能力，预示该调节因子感知其宿主环境的营养组成。为了确定鼠疫耶尔森菌的RovM是否类似地参与代谢过程，在非常基础的最低培养基SMM中，补充了SMM中通常不含的糖和氨基酸后，对野生型、ΔrovM突变体和互补突变体ΔrovM（pACrovM）进行了生长分析。向培养基中添加葡萄糖和半乳糖导致菌株间生长速率没有观察到差异，然而，添加二乙酰壳二糖导致ΔrovM（pACrovM）菌株的生长速率显著高于rovM突变体和野生型菌株。添加麦芽糖和阿拉伯糖显示菌株间生长速率无差异（数据未显示）。
预测鼠疫耶尔森菌在跳蚤肠道中主要利用L-谷氨酸组氨基酸（脯氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酰胺）来支持生长，因此测试了组氨酸、精氨酸和谷氨酰胺支持鼠疫耶尔森菌在SMM中改善生长的能力。有趣的是，虽然ΔrovM突变体和野生型在谷氨酰胺和精氨酸中生长相似，但ΔrovM（pACrovM）菌株在补充这些氨基酸时似乎具有显著增强的生长速率。然而，添加组氨酸支持所有菌株的同等生长速率。
特定的营养环境指导rovM的诱导和RovM相关的rovA抑制
在假结核耶尔森菌中，RovM调节因子在基本营养环境中特异性抑制rovA，而在鼠疫耶尔森菌中，rovM被高度诱导，而rovA在跳蚤体内被高度抑制。我们假设在鼠疫耶尔森菌中，类似且特定的营养环境会导致RovM抑制rovA，并且这包括跳蚤肠道。然而，对ΔrovM突变株跳蚤感染的基因表达分析显示，野生型和ΔrovM突变体之间rovA表达没有显著差异。根据这一发现，还确定了鼠疫耶尔森菌rovA和rovM响应不同营养环境的体外转录水平。进行此实验是为了确定rovM和rovA的诱导环境，以及在某些营养环境中两者之间是否存在相互调节关联。在鼠疫耶尔森菌中，与丰富的LB培养基相比，rovM基因在基本SMM培养基中的转录水平较低。rovA转录水平比rovM高约3倍，并且在两种培养基中，野生型和ΔrovM突变体之间的rovA水平没有差异。
然而，ΔrovM（pACrovM）菌株在LB和SMM葡萄糖中，相对于在相同培养基中生长的野生型，rovM基因表达分别增加了约49倍和约22倍。同时，在LB培养基在rovM过表达的菌株△rovM（pACrovM）中，rovA的表达在LB培养基中被抑制约3倍，但在SMM葡萄糖中未注意到rovA表达差异。然而，在基本SMM培养基补充葡萄糖的情况下，rovA的水平不受rovM影响。
精氨酸被RovM感知以调节生长适应性和生物膜生产
向SMM补充精氨酸作为新的氮源导致△rovM（pACrovM）菌株的生长速率增加。预测精氨酸在跳蚤肠道中被鼠疫耶尔森菌分解代谢，因此测试了野生型、△rovM突变体和互补突变体△rovM（pACrovM）在生物膜生产背景下响应精氨酸的能力。在TMH-gal+arg培养基中缺乏精氨酸，导致具有多个rovM拷贝的菌株，即△rovM（pACrovM）和野生型（pCR_rovM）的生物膜形成显著减少。然而，野生型和△rovM突变株无论TMH培养基中是否存在精氨酸，都能产生可比较量的生物膜。
在TMH-gal+arg培养基中，携带多个rovM拷贝的菌株的生长速率高于野生型和△rovM突变体，类似于在TMH-gal+中的生长。为了评估是否存在精氨酸时rovM转录的差异，测定了在补充精氨酸的SMM培养基中rovM的表达水平。添加精氨酸并未导致rovM诱导，如野生型菌株在SMM加葡萄糖和SMM加精氨酸中rovM的相似表达水平所示。然而，在SMM精氨酸培养基中，△rovM（pACrovM）和野生型（pCR_rovM）菌株中发生rovM过表达，并伴随着rovA抑制，这与在LB培养基中发生的情况一致。
相关新闻推荐
1、引起甜樱桃流胶的病原菌SXYTLJ01生物学特性研究（二）
3、不同酵母的生长曲线、发酵力、耐冻性能测定及发酵面团感官评定（二）