Latrepirdine 在分化 SH-SY5Y 神经元中促进细胞活力并保护免受 α-syn 毒性
我们使用稳定表达、可诱导的 tet-off 系统在分化 SH-SY5Y 神经元中过表达野生型人 α-syn，测试 latrepirdine 是否改变 α-syn 聚集。在该系统中，存在 dox 时 α-syn 表达关闭，在去除 dox 的细胞中表达开启。我们分析了总裂解物、Triton X-100 可溶和不溶性蛋白组分中单体和寡聚体 α-syn 的水平。α-syn 蛋白总水平高于维持在 α-syn 关闭（+ dox）状态的对照细胞。我们观察到，10 nM latrepirdine 处理 14 天后，所有形式的 α-syn 水平均降低，包括 Triton X-100 可溶、总和不溶性组分中的聚集体和可溶性单体（图3a）。使用 LB509 抗 α-syn 抗体进行的蛋白质印迹实验获得了类似结果（数据未显示）。然而，培养 14 天时通过定量逆转录 PCR 测定的 α-syn mRNA 水平无显著差异（图3d），提示 latrepirdine 可能通过翻译后机制调节 α-syn 水平。这与蛋白质降解（例如自噬）在 α-syn 清除中的作用一致。
我们观察到，在不含 dox 的情况下培养 14 天（过表达 α-syn）的分化 SH-SY5Y 神经元表现出增加的坏死性细胞死亡（图3b 和 c）。这一结论得到以下观察的支持：与维持在含 dox 培养基中的细胞相比，过表达 α-syn 的细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）水平升高约 36%（图3c）。此外，我们通过测量这些细胞将四唑盐 MTS 还原为可溶性甲臜的能力来确定剩余非坏死细胞的活力。MTS 代谢能力下降是细胞损伤的指标。我们发现，如 LDH 释放所测（图3c），latrepirdine 处理降低了 α-syn 过表达细胞的细胞死亡；如其还原 MTS 的能力所示（图3b），latrepirdine 处理增加了这些细胞的活力。在 latrepirdine 浓度低至 0.1 nM 时即观察到这种细胞保护作用。作为对照，我们还测量了在不含 dox 的情况下过表达 β-半乳糖苷酶的分化 SH-SY5Y 细胞的细胞死亡和活力（含或不含 dox，含或不含 latrepirdine）。这些细胞在细胞死亡或活力方面未显示显著变化（图3e）。
图3. Latrepirdine 刺激 α-突触核蛋白（α-syn）分解代谢并保护分化 SH-SY5Y 神经元免受 α-syn 相关细胞毒性。稳定表达可诱导（"tet-off"）人 α-syn 的 SH-SY5Y 细胞用视黄酸分化（不含四环素（dox）），并在不含（溶媒；不含 dox）或含 latrepirdine（不含 dox）的情况下处理 14 天。（a）用 10 nM latrepirdine 处理 14 天的细胞被裂解，通过超速离心获得 Triton X-100 可溶（S100，左）和不溶（P100，中）沉淀物（"@"为非特异性条带）。latrepirdine 处理降低了所有形式 α-syn 的水平，包括 Triton X-100 可溶（单体减少 52.7%；标准误 = 10.38；P < 0.01）、总（单体减少 68.0%；标准误 = 15.64；P < 0.01）和不溶性组分（聚集体减少 74.8%；标准误 = 9.397；P < 0.001）中的聚集体和可溶性单体。（b）定量释放到培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）或（c）测定 SH-SY5Y 细胞中四唑盐 MTS 的还原，用于测定在一系列 latrepirdine 浓度（如图所示）存在或不存在时的细胞活力。（d）使用定量逆转录 PCR 分析 α-syn mRNA 水平，标准化为 α-微管蛋白 mRNA 水平。（e）在 96 孔板中培养过表达 β-半乳糖苷酶（β-gal）的可诱导 SH-SY5Y 细胞，在不含 dox 的情况下培养，24 小时后用视黄酸（RA）和不同浓度 latrepirdine（如图所示）处理，并从培养基中定量 LDH 释放。所有图片均为三次或更多独立实验的代表。图表为平均值 ± 标准误。
慢性 latrepirdine 处理与野生型小鼠脑自噬增强和 α-syn 单体减少相关
在一项相关研究中，我们提供证据表明慢性 latrepirdine（每日 3.5 mg/kg）给药可增强自噬、减少 Aβ42 积累并改善 AD 小鼠模型的行为障碍。我们接下来研究对野生型小鼠慢性给予 latrepirdine 3 周是否足以激活自噬和/或改变其脑中的 α-syn 水平。雄性野生型小鼠接受 21 次每日一次腹腔注射，分别为 latrepirdine（3.5 mg/kg；n = 4）或溶媒（0.9% 生理盐水；n = 4）。处理后，处死小鼠，用全脑裂解物通过蛋白质印迹分析自噬标志物（包括 LC3 和多聚泛素结合蛋白 p62/SQSTM1（p62））以及 α-syn 水平（图4）。LC3 通过添加磷脂酰乙醇胺从其胞质前体（LC3-I）转化为其膜相关形式（LC3-II），这使得 LC3-II 得以募集到自噬体外膜。当自噬被诱导时，自噬体积累并成熟，直到与溶酶体融合后终末降解。
图4. Latrepirdine 刺激 α-突触核蛋白（α-syn）分解代谢，同时伴随自噬增强标志物。2 月龄野生型雄性小鼠接受 21 次连续每日一次腹腔注射 3.5 mg/kg latrepirdine（n = 4；LAT）或等体积溶媒（0.9% 生理盐水；n = 4；VEH）。（a）对野生型小鼠脑进行蛋白质印迹分析，检测可溶性 α-syn、p62 和 LC3 蛋白水平。（b–d）蛋白质印迹条带积分密度定量。图表为同窝小鼠的代表；*P < 0.05。
经过 21 天 latrepirdine 处理后，我们注意到野生型小鼠脑中 α-syn 单体显著减少，同时 LC3-II 积累显著升高，但 p62 无积累。这些结果支持以下假设：latrepirdine 在野生型小鼠脑体内刺激 α-syn 降解，这可能是通过诱导自噬实现的，这一观察与我们最近的报告相吻合。此外，当前结果提示 α-syn 单体的周转可能至少部分由自噬状态决定，这提示增强的自噬活性可能减轻与 α-syn 细胞积累相关的毒性。使用表达人 α-syn 的细胞和动物模型进行的 latrepirdine 实验将有助于阐明 latrepirdine 在清除病理性 α-syn 方面对自噬途径调节的具体作用机制。
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