结果
Latrepirdine 保护酿酒酵母免受 α-syn 毒性
我们使用酿酒酵母模型系统研究 latrepirdine 是否能保护细胞免受 α-syn 或与神经退行性疾病相关的一系列蛋白质毒性物种的伤害（表1）。在酿酒酵母中整合单个拷贝的 α-syn（1XαSyn）对细胞生长无明显影响。然而，将 α-syn 基因剂量从 1 个拷贝增加到 2 个拷贝（2XαSyn）会导致生长停滞和细胞死亡。为验证 latrepirdine 是否能保护酵母免受 α-syn 毒性，我们在不同浓度 latrepirdine 存在下监测 2XαSyn 菌株及其同基因野生型（W303a）菌株的生长（图1a–c）。Latrepirdine 处理与 2XαSyn 菌株持续活力相关，对 W303a 菌株生长无影响。我们得出结论，latrepirdine 处理与 α-syn 过表达情况下细胞活力的维持相关，这可能与该药物对蛋白质降解的作用有关。
| 菌株 | 基因型 | 参考文献 |
|---|---|---|
| W303α | MATa ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1, ura3-1 | Cooper 等 |
| 2XαSyn | α-突触核蛋白整合至 W303α 的 HIS3 和 TRP1 位点（IntTox） | Cooper 等 |
| 1XFUS | FUS/TLS 整合至 W303α 的 TRP1 位点 | |
| 2XTDP43 | TDP43 整合至 W303α 的 HIS3 和 TRP1 位点 | |
| Htt103Q | 含 103 个谷氨酰胺的 N 端亨廷顿片段整合至 W303α 的 HIS3 位点 | |
| YTS158 | BY4742 整合 pho8Δ::pho8Δ60 (URA3) pho13Δ::Kan | He 等 |
| Atg8Δ2XαSyn | 2XαSyn 整合 atg8Δ::LEU2 | 本研究 |
图1. Latrepirdine 保护酿酒酵母免受 α-突触核蛋白（α-syn）的细胞毒性，但不保护免受 TDP-43、FUS 或 Htt-103Q 的细胞毒性。（a）2XαSyn 菌株及其同基因野生型（W303a）菌株在棉子糖培养基中培养至对数中期，稀释后点种到 YP 葡萄糖平板（α-syn "关闭"）和 YP 半乳糖平板（α-syn "开启"）上，在不含或含 latrepirdine 的情况下培养（照片在 30°C 生长 2 天后拍摄）。（b）W303a 或（c）2XαSyn 菌株在 YP 半乳糖培养基（α-syn "开启"）中，在不含或含 latrepirdine（浓度如图所示）的情况下培养。（d）1XFUS、（e）2XTDP43 和（f）1XHtt103Q 菌株在 YP 半乳糖培养基（表达 "开启"）中，在不含或含不同浓度 latrepirdine（如图所示）的情况下培养。所有图片均为三次或更多独立实验的代表，每次实验重复进行两次或三次。图表为平均值 ± 标准误。
为验证 latrepirdine 对蛋白质毒性的保护是否对 α-syn 特异，我们还研究了 latrepirdine 对其他酿酒酵母神经退行性疾病蛋白质毒性模型的影响，包括与肌萎缩侧索硬化相关的基因 TDP43（2XTDP43）和 FUS（1XFUS），以及 HD 相关的 htt-103Q。尽管这些蛋白质各自均有形成对酵母有毒的聚集体的公认特性，latrepirdine 仅对 α-syn 的蛋白质毒性提供特异性保护（图1a–c）；即该药物无法保护细胞免受与 FUS、TDP43 或 Htt-103Q 相关的蛋白质毒性（图1d–f）。蛋白质毒性异质性的一个潜在因素可能是聚集体积累的不同细胞内区室。蛋白质毒性在同一多肽内也存在异质性，例如朊蛋白株现象所示，其中一些朊蛋白聚集体对细胞无害且耐受良好，而另一些聚集体则具有毒性并导致可传播性海绵状脑病。这两种现象中的任一种或两者都可能至少部分解释 latrepirdine 对某些而非全部有毒聚集体的差异性拯救。在相关研究中，我们报告 latrepirdine 通过诱导自噬保护酵母免受与 Aβ42 积累相关的蛋白质毒性，在哺乳动物细胞系和鼠脑中也有同样作用。此处显示的 latrepirdine 对 α-syn 的特异性，结合这两份报告，提示 latrepirdine 处理后，α-syn 或 Aβ42 聚集体形成的纤维状组装可能被自噬途径优先靶向降解。
遗传学和药理学证据表明 latrepirdine 介导的酵母免受 α-syn 毒性的保护涉及自噬
我们试图确定 latrepirdine 保护酵母免受 α-syn 毒性是否归因于自噬的激活——自噬是一种调节长寿命蛋白质、细胞器和蛋白质聚集体降解的保守途径。向酵母培养物中添加雷帕霉素即使在营养丰富的培养基中也能强烈诱导自噬。使用非特异性自噬的酵母报告系统（其中自噬体成熟激活碱性磷酸酶；YTS158 菌株），我们观察到 latrepirdine 处理后碱性磷酸酶活性显著且剂量依赖性增加，提示 latrepirdine 激活自噬（图2a）。由于我们观察到 latrepirdine 在哺乳动物细胞系和鼠脑中诱导 mTOR 依赖的自噬，我们试图确定雷帕霉素靶蛋白依赖的自噬激活是否也能保护 2XαSyn 菌株免受 α-syn 毒性。用雷帕霉素（10 mM）处理酵母也与 2XαSyn 细胞活力显著增加相关，进一步证实刺激自噬活性足以防止 2XαSyn 模型中与 α-syn 聚集相关的蛋白质毒性（图2b）。
ATG8（酵母 LC3 同源物）编码自噬体形成所需的泛素样蛋白。为验证 latrepirdine 介导的免受 α-syn 毒性的保护涉及自噬这一假设，我们将 2XαSyn 菌株与 atg8Δ::LEU2 菌株杂交（Atg8Δ2XαSyn；表1）。在不含或含 100 μM 或 250 μM latrepirdine 的情况下培养 Atg8Δ2XαSyn 培养物，并通过 OD600 监测生长（图2c）。虽然 100 μM latrepirdine 与 2XαSyn 菌株免受 α-syn 毒性相关（图1a–c），但该浓度不足以保护 Atg8Δ2XαSyn 菌株（图2c）。然而，更高浓度的 latrepirdine（250 μM）似乎为 Atg8Δ 提供了部分免受 α-syn 毒性的保护（图2c）。这一观察提示 latrepirdine 可能通过至少一条涉及 Atg8 依赖自噬调节的途径保护细胞免受 α-syn 相关毒性。与先前观察相反，Atg8 依赖自噬的缺失导致 Atg8Δ2XαSyn 在生长 24 小时后细胞活力较 2XαSyn 细胞增加，尽管在所有时间点两者均较同基因野生型菌株活力低（图2d）。我们提出，在生长 24 小时后可能诱导了一种对 Atg8Δ2XαSyn 菌株生存具有选择性的补偿机制，从而使细胞活力适度改善。未来研究计划更详细地研究这些途径，以理解自噬缺陷型 Atg8Δ2XαSyn 在 24 小时后生存改善的潜在机制。
图2. Latrepirdine 或雷帕霉素通过诱导自噬保护免受 α-突触核蛋白（α-syn）相关细胞毒性。（a）在 YTS158 菌株中，自噬体成熟导致功能性碱性磷酸酶激活。YTS158 菌株在合成培养基中培养至对数期，在不含或含所示浓度 latrepirdine 的情况下测定碱性磷酸酶活性。（b）2XαSyn 菌株在 YP 半乳糖培养基（α-syn "开启"）中，在不含或含雷帕霉素（浓度如图所示）的情况下培养。（c）Atg8Δ + 2XαSyn 培养物在 YP 半乳糖培养基（α-syn "开启"）中，在不含或含不同浓度 latrepirdine（如图所示）的情况下培养，并通过测定 OD600 监测生长。（d）2XαSyn、其同基因野生型（W303a）和缺失 ATG8 基因的 2XαSyn（Atg8Δ + 2XαSyn）在 YP 半乳糖（α-syn "开启"）培养基中 30°C 摇床培养。使用 Bioscreen 机器每 1 小时通过 OD600 监测细胞生长。所有图片均为三次或更多独立实验的代表，每次实验重复进行两次或三次。图表为平均值 ± 标准误。
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