LamN介导的坎氏弧菌生长与表达
先前已证明，弧菌属的非发光成员（如灿烂弧菌）能够利用海带多糖作为唯一碳源，并且这种海带多糖酶活性可以在海带多糖存在下被诱导。然而，负责这些观察结果的酶尚未被鉴定。在本研究中显示携带lamN基因的七株坎氏弧菌分离株中，六株能够在使用海带多糖作为唯一碳源时进行二分裂，达到≥1×10⁸菌落形成单位/mL的细胞密度（表1）。唯一的例外是菌株501J，一株来自美国佛罗里达州博卡谢加湾的地表水分离株。该分离株被证明携带全长lamN基因序列，没有导致移码或提前终止的突变。然而，对来自含lamN的坎氏弧菌菌株、弧菌属HENC-03和轮虫弧菌的100 bp UTR序列（LamN翻译起始位点上游）的比较显示，菌株501J在-21位有一个点突变（A→G）。启动子/UTR序列中的点突变可能对转录因子结合产生不利影响，从而损害弧菌属成员的基因表达，这并不罕见。有趣的是，除了lamN之外，对501J基因组的检查还揭示了三个额外的ORF，推定编码两个β-糖苷酶和一个纤维二糖酶（EC 3.2.1.21），但该菌株仍然不能利用海带多糖进行复制。虽然这些基因在测试条件下的表达情况尚不清楚，但这可能表明lamN在坎氏弧菌海带多糖利用中的重要性。
qRT-PCR分析显示，与在葡萄糖或甘油上生长的相同菌株相比，在海带多糖上生长的细菌分别显示lamN基因表达诱导17至314倍和4至66倍（表1）。还对来自相同培养物的粗细胞提取物进行了LC-MS/MS分析以确认LamN蛋白表达。当在海带多糖上生长时，除菌株501J（不能在海带多糖中培养）和菌株CAIM 198外，每株菌株至少鉴定出一个独特的LamN肽段，确认了酶的表达（表1）。对菌株CAIM 198进行LamN检测的几次靶向尝试均未成功。与菌株CAIM 198类似，菌株42A也显示出相对较低的lamN基因诱导，并且仅从该菌株中鉴定出一个LamN肽段。正如每株菌株鉴定的独特LamN肽段数量所确定的，蛋白质丰度与海带多糖存在下lamN诱导水平很好地对应。因此，尽管检测到lamN基因表达，但LamN蛋白表达可能低于所用方法对菌株CAIM 198的检测阈值。
| 菌株 | 生长情况 | lamN基因表达a | LamN蛋白表达b | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 葡萄糖 | 甘油 | 昆布多糖 | 葡萄糖c | 甘油c | 昆布多糖c | 葡萄糖 | 甘油 | 昆布多糖b | |
| WY01 | + | + | + | 1.27E+05 ± 6.33E+03 | 2.07E+05 ± 1.30E+04 | 2.19E+06 ± 7.51E+04 (7/71) | - | - | + (7) |
| 602L | + | + | + | 1.81E+05 ± 5.80E+03 | 1.85E+05 ± 9.07E+03 | 1.22E+07 ± 1.47E+06 (86/86) | - | - | + (7) |
| CAIM 115 | + | + | + | 9.66E+04 ± 9.62E+03 | 1.02E+05 ± 1.14E+04 | 1.68E+06 ± 2.01E+05 (17/17) | - | - | + (7) |
| 5021 | + | + | - | 1.49E+04 ± 2.34E+03 | 2.43E+04 ± 4.76E+03 | n.d. | - | - | n.d. |
| 42A | + | + | + | 6.26E+04 ± 1.01E+04 | 1.13E+05 ± 5.07E+03 | 1.04E+06 ± 2.52E+04 (7/79) | - | - | + (1) |
| 9078-83 | + | - | + | 7.92E+04 ± 4.80E+03 | n.d. | 2.49E+07 ± 4.50E+06 (14/14) | - | - | + (11) |
| CAIM 158 | + | + | + | 7.50E+04 ± 2.30E+04 | 3.11E+05 ± 5.07E+04 | 1.55E+06 ± 2.02E+05 (8/4) | - | - | + (4) |
| a使用qRT-PCR对中期培养物总细胞RNA提取物测得的拷贝数。数据为三次独立测定的平均值±标准差。 b使用LC-MS/MS对中期培养物无细胞提取物进行的蛋白质组学分析。 c通过相似性测试参考菌株AA-1116（不干扰lamN基因）确定在葡萄糖/甘油中生长时的测量背景为2.30E+04。 d与在葡萄糖/甘油中生长相比的倍数增加（括号内）。 e使用LC-MS/MS鉴定出的独特肽段数量（括号内）。 n.d., 使用这些碳源无法生长该菌株。 | |||||||||
一般来说，弧菌属对海带多糖的有效利用需要细胞外GH活性来启动海带多糖聚合物（通常20-30个葡萄糖基团）水解成更小的寡糖（或单糖）。这些可运输的产物随后可能在周质中由LamN进一步水解成葡萄糖，正如PSORTb v3.0.2分析预测LamN定位于周质，或由其他GH水解，随后通过磷酸烯醇式丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统、ABC转运体或离子依赖型转运体导入细胞质。有趣的是，轮虫弧菌、麦氏弧菌和创伤弧菌的含lamN基因座也携带一个β-葡聚糖酶（bgl）基因，该基因预测编码细胞外GH16（海带多糖酶，内切-1,3-β-葡聚糖酶）。对这些GH16蛋白质序列的SignalP 4.1分析表明它们都含有信号肽，PSORTb v3.0.2分析将它们鉴定为具有周质和细胞外定位。因此，对于这三种弧菌属物种/菌株，细胞外伴侣酶似乎可以与LamN在同一基因座中找到。然而，对于本研究中的坎氏弧菌菌株，情况并非如此。使用原始自动注释和CAZymes分析工具包重新注释对坎氏弧菌HY01草图基因组的进一步检查，共鉴定出31个推定的GH。其中五种推定酶属于GH3家族（可水解β(1,3)键的外切-β-葡糖苷酶）。基因组中没有其他预测酶可归因于任何其他已知水解β(1,3)键的GH家族（即GH5、GH16、GH17、GH55、GH64、GH81）。因此，虽然坎氏弧菌HY01基因组不编码预期的分泌伴侣酶（如GH16），但海带多糖的水解确实似乎正在发生。
对来自在海带多糖中生长的中期培养物的浓缩无细胞上清液进行LC-MS/MS分析，以潜在鉴定可能具有水解海带多糖能力的细胞外酶。从坎氏弧菌HY01细胞外蛋白质组中鉴定出59种蛋白质。虽然LamN未在细胞外环境中检测到，但鉴定出的第八大丰度蛋白质是一种1109 AA的预测1,4-β-D-葡聚糖葡萄糖水解酶（EC 3.2.1.21，GenBank登录号EDL68652.1）。该蛋白含有GH3 N端和C端结构域，PSORTb 3.0.2分析预测该酶定位于周质和细胞外环境。额外的LC-MS实验已在坎氏弧菌菌株HY01、CAIM 115和CAIM 198的无细胞上清液中鉴定出该蛋白，但仅当细胞使用海带多糖作为碳源生长时，表明该酶与LamN一样，也被海带多糖诱导。我们目前正在测试该细胞外酶是一种具有水解β(1,3)键能力的混合键葡糖苷酶的假设。最后，LC-MS/MS分析中鉴定出的三种最丰富的蛋白质（一个ABC型糖转运系统周质组分，编码位置距lamN 17个ORF，一个周质麦芽糖结合蛋白和一个麦芽糖孔蛋白）也暗示了海带多糖衍生寡糖转运和海带多糖利用成员的候选者。
二糖和多糖底物特异性
对于动力学分析，lamN从相同的pET-22b质粒在17°C下表达并过夜诱导。该方法产生了大量可溶且有活性的酶，可通过渗透休克从周质中轻松纯化（1.5 L LB培养基产率=15 mg）。在圆二色光谱中观察到显著的α螺旋含量，与蛋白质折叠一致。
图2. 酶稳态动力学。(a) 龙胆二糖、海带多糖和地衣素获得双曲线。(b) 海带二糖获得S形曲线。
海带多糖酶能够催化β-1,3和β-1,4键的水解，并且内切-β-1,3-D-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6）和外切-β-1,3-D-葡聚糖酶（EC 3.2.1.58）都已被描述。使用六种二糖底物测试纯化LamN的底物特异性（表2）。坎氏弧菌HY01 LamN对海带二糖（β-1,3）有强烈偏好，但也催化纤维二糖（β-1,4）和龙胆二糖（β-1,6）的水解。已证明的水解β-1,3和β-1,6键的能力表明LamN可能将金藻昆布多糖完全水解成葡萄糖。对于龙胆二糖和海带多糖，获得了双曲线（图2a），而对于海带二糖，获得了Hill系数nH = 4.1 ± 0.6的S形曲线，表明三到四个海带二糖分子可以结合一个酶分子（图2b）。海带二糖观察到的正协同性与变构底物结合位点一致；先前在大麦外切酶I中观察到协同性，但用的是大麦1,3;1,4-β-D-葡聚糖（nH = 2）。测试的所有α-D-葡聚糖都不是LamN的底物。这与基于序列相似性和底物特异性的酶分类一致。
表2. 坎贝尔弧菌（Vibrio campbellii）LamN底物特异性和动力学| 二糖或多糖 | 单位 | 亚基1 | 亚基2 | 连接键 | 葡萄糖生成量 | 浓度范围 | 水解 | kcat (1/min) | Km或Kd (mg/mL或mM) | kcat/Km (1/min/mM) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 蔗糖 | 葡萄糖 | 果糖 | 葡萄糖 | α(1,2) | 1.90 ± 0.10 (N.D.) | 4-8 mM | 否 | 20 000 ± 1000 | 1.3 ± 0.3 mM | - |
| 龙胆二糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | β(1,6) | N.D. | 0.4-4 mM | 否 | - | - | 15 000 |
| 乳糖 | 葡萄糖 | 半乳糖 | 葡萄糖 | β(1,4) | N.D. | 0.4-360 mM | 否 | - | - | - |
| 麦芽糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | α(1,4) | 870 ± 50 (N.D.) | 0.4-8 mM | 是 | 88 000 ± 5000 | 2.9 ± 0.2 mM | 30 000 |
| 纤维二糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | β(1,4) | 3.90 ± 10 (N.D.) | 0.2-4.0 mM | 是 | 59 000 ± 1000 | 2.6 ± 0.8 mM | 23 000 |
| 地衣多糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | β(1,3)和β(1,4) | 1 500 ± 800 (N.D./mg) | 0.13-2.6 mg/mL | 是 | - | 3 ± 2 mg/mL | - |
| 昆布多糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | β(1,3)和β(1,6) | 0.5 ± 0.1 (N.D./mg) | 0.27-6.3 mM | 是 | 50 ± 10 | 4 ± 2 mM | - |
| 昆布多糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | β(1,3)和β(1,6) | 13 ± 3 (N.D./mg) | 1.2 to 7.4 mg/mL | 否 | - | 16 ± 6 mg/mL | - |
| 昆布多糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | β(1,3)和β(1,6) | - | 1 mg/mL | 否 | - | - | - |
| 动物脏器 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | 葡萄糖 | β(1,4) | 0.029 ± 0.002 (N.D./mg) | 30 mg/mL | 是 | - | 不可溶 | - |
| N.D., 未检测到 - 表示吸光度值未超过2倍背景值。 a甘露糖15葡萄糖单位每聚集体，MW = 1600 g/mol。 b对于多糖，每毫克酶每分钟产生的葡萄糖微摩尔数记录在30 mM葡萄糖二糖底物分子上。 | ||||||||||
测试了多糖地衣素（苔藓淀粉）、海带多糖和纤维素。观察到对地衣素（β-1,3和β-1,4）、海带多糖（β-1,3和β-1,6）和纤维素（β-1,4）的催化水解。类似地，大麦外切酶I强烈偏好β-1,3葡聚糖，但也水解β-1,3;β-1,4和β-1,3;β-1,6葡聚糖。Lafond等人描述的GH 131家族水解酶也被报道具有广泛的底物特异性（外切-β-1,3和β-1,6水解酶活性与β-1,4内切水解酶活性结合）。
鉴定内切-GH活性的一般定性方法是使用染色多糖如海带多糖天青。外切-GH释放非常有限的染料，因为当酶到达连接到糖的一个羟基上的第一个染料取代基时水解停止，而内切-GH释放大量80%乙醇可溶性染色糖。坎氏弧菌LamN未显著水解海带多糖天青底物，与外切-β-1,3或外切-β-1,6活性或两者一致（表2）。
还通过圆二色光谱监测热变性。蛋白质从20°C加热到100°C，然后冷却到20°C。LamN在20°C和70°C之间没有显著变性，椭圆度保持大致恒定；观察到可逆的重折叠。这种类型的热稳定性先前已在那不勒斯热袍菌的LamA海带多糖酶中报道，但两种酶在成对比对中不共享任何显著的序列同一性。
结论
在本研究中，我们鉴定了一种新型β-糖苷酶（LamN），它是一种海带多糖诱导的外切海带多糖酶，能够水解β-1,3、β-1,4和β-1,6键。作为实际问题，这种热稳定酶的广泛底物特异性、易生产和纯化可能支持其在各种生物技术应用中的使用。就碳循环和利用浮游植物水华产生的海洋碎屑而言，LamN应使发光的坎氏弧菌能够利用海洋环境中最丰富的碳源之一，因为纯化的海带多糖酶已被证明可以消化来自不形成群体的和形成群体的球状棕囊藻菌株的储存葡聚糖。
棕囊藻水华还以浮力群体细胞或释放的海洋凝胶形式提供丰富的定殖表面，这些可能作为方便且受限的微生境，用于浓缩营养物、酶、群体感应自诱导剂、氧气和弧菌细胞：所有这些元素足以解释乳海中观察到的特征性表面生物发光。有趣的是，荧光素酶合成在发光弧菌中易受D-葡萄糖介导的分解代谢物阻遏（尽管已知存在天然非敏感突变体）。在分解代谢物阻遏的情况下，海带多糖的利用可能支持坎氏弧菌生长的初始爆发，但有可能限制生物发光，因为海带多糖酶的产生以及随之而来的葡萄糖浓度增加。然而，随着棕囊藻水华的衰亡伴随着各种溶解有机物的大量释放，代谢多样的"饱食-饥荒"策略家如坎氏弧菌可能利用碎屑中的无数有机化合物，其中大多数将支持生物发光的产生。
在这种情况下，海带多糖的利用可能确实意义不大，因为坎氏弧菌相对较快的生长速率可能使这种生物通过从邻近生物的大量营养通量和细胞外水解酶中获益最多，从而扮演"机会主义追随者"的角色。关于乳海的形成和消散，目前尚不清楚发光坎氏弧菌是否只是参与藻类衍生有机物连续分解的许多种群之一，或者正如最近对密切相关的新单胞菌属（Alteromonas）所证明的那样，它们单独耗尽了沿海表层海水中的溶解有机碳库。无论哪种情况，继续研究能够如此爆发性生长的弧菌属的碳水化合物利用，特别是在它们已知是复制最快的细菌的温暖水域中，无疑将使我们更好地理解它们在海洋生态系统碳循环中可能发挥的更广泛且潜在不成比例的作用。
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