2.4. 质粒稳定性测定
菌株χ12042(pYA5383)和χ12094(pYA5383)的质粒稳定性在补充0.05%阿拉伯糖、0.1%甘露糖的LB肉汤中，在选择性（不含DAP）与非选择性条件（含DAP）下测定。过夜培养的疫苗株（T₀）稀释1:1000到预热的上述补充LB中，37°C有氧培养12小时。此过程重复约50代（最后传代称为T₅），测定每个培养物中保留Asd⁺质粒的细胞比例。每个连续培养的细胞稀释后涂布到补充0.05%阿拉伯糖、0.1%甘露糖和50μg/ml DAP的LB琼脂平板上。从每个时间点每个培养物中挑选100个菌落，点种到补充0.05%阿拉伯糖和0.1%甘露糖、含或不含50μg/ml DAP的LB琼脂上。通过计数在含和不含DAP的LB琼脂上生长的菌落，确定每个培养物中保留质粒的克隆百分比。50代后还检查了这些克隆持续合成LcrV-196、Psn和/或F1的能力。
2.5. 生长动力学
菌株χ12042(pYA5383)、χ12094(pYA5383)、χ12042(pYA3841)和χ12042(pYA3620)的生长速率通过在补充0.05%阿拉伯糖和0.1%甘露糖的LB中培养测定。简要地，过夜培养物稀释1:1000或1:10000到250μl预热的上述补充LB中，使用Bioscreen C MBR（Oy Growth Curves Ab Ltd., Finland）37°C培养。250μl培养体积以三份加入蜂窝多孔板。Bioscreen微生物生长曲线分析仪设置为以30分钟间隔测量培养物在OD600nm的光密度，培养温度37°C，持续24小时。
2.6. 蛋白质合成与纯化
携带pYA4836(lcrV-6xHis)、pYA5049(psn-6xHis)和pYA5338(caf1-6xHis)的大肠杆菌TOP10在补充100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中37°C过夜培养。蛋白质合成和纯化程序在我们之前的研究中已有描述。
2.7. SDS-PAGE和Western blot分析
鼠伤寒沙门氏菌株χ12042(pYA5383)或χ12094(pYA5383)或空质粒在含0.05%阿拉伯糖和0.1%甘露糖的LB中37°C培养。当细菌达到OD600为0.8时，向培养物中加入1mM IPTG以诱导异源耶尔森菌蛋白合成。细菌沉淀和培养上清中的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上，如前所述。蛋白质通过兔多克隆抗LcrV抗体、兔多克隆抗Psn抗体和小鼠单克隆抗F1抗体检测。
2.8. 小鼠免疫
所有动物实验均经亚利桑那州立大学机构动物护理和使用委员会批准。7周龄雌性BALB/c小鼠（每组n=10）购自Charles River Laboratories。免疫程序遵循之前的描述。简要地，免疫前小鼠禁食禁水4小时，30分钟后重新供给。小鼠在第0天口服免疫含10⁹ CFU各菌株的20μl BSG，或20μl BSG作为阴性对照，第10天加强免疫。在第0、14和28天分别采集血样，离心后收集血清进行抗体反应个体分析。Nunc Immunoplate Maxisorb F96平板（Nalge Nunc）用纯化重组LcrV（100ng/孔）、Psn（100ng/孔）或F1（100ng/孔）包被，4°C过夜。抗体滴度测量程序按照我们之前的报告进行。
2.9. 鼠疫耶尔森菌攻击
鼠疫耶尔森菌CO92在BALB/c小鼠中的皮下和鼻内LD₅₀分别为<10 CFU和约100 CFU。攻击在第二次免疫后4周（第38天）进行。对于皮下攻击，每只动物接受5.7×10³ CFU鼠疫耶尔森菌CO92（约570 LD₅₀），100μl BSG，在含0.2%木糖的HIB中28°C新鲜培养。对于鼻内攻击，小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪混合麻醉。然后每只小鼠鼻内给予约5×10³ CFU鼠疫耶尔森菌CO92（50 LD₅₀），20μl BSG，在含0.2%木糖和2mM CaCl₂的HIB中37°C新鲜培养。小鼠每天观察，攻击后15天记录死亡率。
2.10. SCID小鼠测试
使用7周龄SCID Beige小鼠（每组n=6或8）评估RASV株χ12042和χ12094的安全性。小鼠口服单剂量1×10⁹ CFU的携带三种质粒之一的χ12042菌株（pYA3841、pYA3620、pYA5383）或χ12094(pYA5383)菌株。这些小鼠被观察60天，记录死亡率和发病率迹象。
2.11. 统计分析
抗体反应使用双因素方差分析比较。生存曲线分析使用log-rank（Mantel-Cox）检验。数据以均值±标准差表示。P值<0.05被认为有统计学意义。
3. 结果
3.1. 构建改进的RASV以递送鼠疫耶尔森菌多种保护性抗原
在使用三种鼠伤寒沙门氏菌RASV株进行人体试验时，我们的研究结果使我们认识到某些突变在RASV株的免疫原性和安全性中的关键作用。最重要的变化之一是将ΔrelA198::araC PBAD lacI TT突变替换为ΔrelA197::araC PBAD lacI TT突变，以增加体内抗原合成水平，这与在阿拉伯糖存在下生长期间较低的LacI合成水平相关。Δ(wza-wcaM)-8基因缺失阻止了荚膜酸（如同Δ(gmd-fcl)-26）以及O抗原荚膜的合成，以进一步减少生物膜形成。此外，Δ(wza-wcaM)-8突变增加了保护性抗原合成水平，从而增强免疫应答。ΔPfur81::TT araC PBAD fur突变被ΔPfur33::TT araC PBAD fur突变替换，因为具有后者的突变株定植更好并诱导更高的免疫应答。值得注意的是，我们最近的发现表明，具有Δpmi、ΔPfur33::TT araC PBAD fur和ΔPcrp527::TT araC PBAD crp的RASV株在免疫缺陷小鼠中是安全的。RASV asdA突变株是DAP依赖性的，需要携带野生型asdA基因的质粒来建立互补。在这里，我们使用含这些最佳突变的自杀载体通过接合构建了鼠伤寒沙门氏菌株，形成χ12042（表1）。
我们发现，在χ12042中，含Plpp-lacO-caf1M-caf1A-caf1或甚至Plpp-lacO-2-caf1M-caf1A-caf1（Plpp-lacO-2在caf1M起始密码子前含有6个额外碱基以减少F1合成）的质粒导致F1高水平合成，这对细菌生长产生不利影响并诱导较差的保护性免疫。因此，我们将Plpp-lacO-caf1M-caf1A-caf1构建整合到χ12042染色体中以获得χ12094（表1），以降低F1合成水平。结果表明，F1被检测到但未降低细菌生长。
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