2.5 CZ05菌株发酵过程特性研究
采用1号至4号培养基表征CZ05菌株在不同营养环境中的生长情况。在4号培养基培养过程中，选择pH 3–12作为CZ05菌株的培养条件。使用微生物生长曲线分析仪（OY Growth Curves Bioscreen C，芬兰）和pH计（Mettler FE20K，瑞士）测定CZ05菌株的生长情况。
采用两种培养基（1号和4号）在pH 7.0下进行批次培养，以进行生物降解测试。甲硫醇浓度为100 mg/100 mL无机盐培养基（1000 ppm）。培养物接种纯菌株CZ05。同时准备空白培养物（不加菌）。培养物在250 mL密封瓶中装入100 mL培养基，120 rpm、30°C振荡培养。通过顶空气相色谱法检测培养物中甲硫醇浓度的变化。同时通过分光光度计（Bio-rad Smart，美国）在600 nm处测定光密度（OD600）监测菌株生长。用pH计测定培养基中pH的变化。
2.6 生物滴滤池
构建了一个串联运行的生物滴滤池，由两个塔（38 mm内径 × 800 mm）组成，内装火山岩（8–10 mm内径）。两个塔各连接一个相分离器和一个生物反应器。相分离器用于分离循环液中的固体颗粒。生物反应器用于培养菌株和维持塔内温度。生物滴滤池示意图见图1。含甲硫醇的氮气（模拟沼气）在室温下从第一塔底部供给。氮气流速以空床停留时间（EBRT）表示。第一生物反应器中储存的生长培养基循环流动，为固定在火山岩上的细胞提供营养，并去除第一塔中产生的硫颗粒和硫酸盐。空气流鼓泡进入第一生物反应器，通过液流为第一塔中固定的细胞供氧。从第一生物反应器排出的含甲硫醇气体在室温下从第二塔底部供给，以去除剩余的甲硫醇。第二生物反应器中储存的培养基循环流动，为第二塔中固定的细胞提供营养。两个填充塔通过用500 mL CZ05菌株LB培养基（OD600约1.0）浸泡滤料3小时进行接种。操作系统中循环3 L 1号或4号培养基。当火山岩上出现菌落时，将循环培养基完全更换为3 L新鲜培养基。此时，24小时生物膜培养阶段完成。含甲硫醇的氮气从第一填充塔底部供给。空气鼓泡进入第一生物反应器，然后进入第二塔。通过GC检测两塔进出口甲硫醇浓度。
图1. 实验室规模生物滴滤池示意图。 1.调节器；2.甲硫醇气瓶；3.控制阀；4.流量计；5.填充塔；6.相分离器；7.发酵罐；8.液体泵。
2.7 降解途径操作
串联运行生物滴滤池运行时，气体流量从0.09变化至1 m³/h，但进口甲硫醇浓度不变。随后，进口甲硫醇浓度从20变化至80 ppm，而气体流量不变。通过GC检测出口甲硫醇浓度。
利用第一塔中的甲硫醇代谢产物测试降解途径。液相中的挥发性物质通过顶空气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890A-5975C，美国）检测。
硫酸盐和硫代硫酸盐浓度通过离子色谱法测定。硫浓度根据硫质量平衡计算。
2.8 甲硫醇氧化酶提取液的制备
将CZ05细胞悬浮于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）中，用高压均质机（Niro Soavi 1100，意大利）在130 MPa下破碎，制备胞内酶提取液。40,000g、4°C离心30分钟后所得上清液直接用于酶活测定。将培养液10,000g、4°C离心30分钟，提取上清液制备胞外酶提取液，用于后续使用。
2.9 硫化氢的添加
将硫化氢（0–500 ppm）逐渐加入第一塔进口气流中，以研究硫化氢对甲硫醇降解的影响。通过GC检测进出口甲硫醇和硫化氢浓度。调节鼓入第一生物反应器的空气流量，检测第一生物反应器中培养液的溶解氧（DO）。
3. 结果与讨论
3.1 CZ05菌株的分离与鉴定
以活性污泥为接种物，成功富集并分离得到甲硫醇利用菌，接种于以甲硫醇为碳源和能源的1号培养基中。首先选择低浓度甲硫醇，因为菌株必须适应利用甲硫醇并避免生长抑制。在生长培养基中采用低浓度甲硫醇后，接种高浓度甲硫醇培养基。经过六次连续转接后，将培养物划线于平板上，在含甲硫醇气相的罐中培养约3天。小菌落可见时，显微镜检查菌落。选取若干菌落进行继代培养。选择生长最快的菌落CZ05进行进一步研究。产孢CZ05细胞为杆状，大小2.0–4.0 × 0.6–0.8 μm，革兰氏阴性，兼性厌氧。1号培养基平板上的菌落小而呈牡蛎白色，直径1–1.5 mm。
Biolog微 station系统结果显示，CZ05菌株能够完全利用95种碳源中的28种。该菌株被鉴定为多粘类芽孢杆菌，概率100%。16S rDNA序列与公共数据库（Gene Bank）进行比对，结果显示该菌株与类芽孢杆菌属相似度99%。因此，将CZ05菌株命名为多粘类芽孢杆菌CZ05。
3.2 多粘类芽孢杆菌CZ05发酵过程特性研究
利用甲硫醇的多粘类芽孢杆菌CZ05为兼性厌氧菌，因此可用于去除沼气中的甲硫醇。多粘类芽孢杆菌作为生防细菌已有报道，但本研究首次报道多粘类芽孢杆菌作为甲硫醇利用菌。因此，研究多粘类芽孢杆菌CZ05在发酵过程中的特性是必要的。
如果在无机培养基中添加有机碳源，菌株生长会更快。因此，选择四种培养基研究菌株利用碳源的特性。使用Bioscreen C通过每小时测定浊度记录生长曲线（图2a）。多粘类芽孢杆菌CZ05既是化能自养菌（1号培养基中）又是化能异养菌（2号和3号培养基中）。多粘类芽孢杆菌CZ05在四种培养基中均生长良好。然而，当培养基中存在有机碳源时，其生长迅速。延迟期和对数期的生长顺序如下：延迟期为4号 > 3号 ≈ 2号 > 1号（与维持时间呈反比关系），稳定期为1号 > 4号 > 3号 > 2号（按维持时间）。CZ05菌株在4号培养基中延迟期短、稳定期长。
首先在两种培养基（1号和4号）中进行批次培养，以进一步研究多粘类芽孢杆菌CZ05对甲硫醇的降解。结果见图2b。多粘类芽孢杆菌CZ05在1号和4号培养基中均能有效降解甲硫醇；100小时时降解率分别达到91%和99%。4号培养基中的生物降解性能优于1号培养基，且细菌浓度更高（图2b）。这是生物滴滤池运行过程中的必要条件。因此，选择4号培养基进行进一步研究。
选择pH 3–12作为4号培养基中的培养条件，以研究多粘类芽孢杆菌CZ05的pH耐受性。结果通过Bioscreen C每小时测定浊度记录（图2c）。该菌株在pH 4–9范围内生长良好，但在pH 11–12下不生长。pH 3和pH 10条件下10小时内观察到较长的延迟期。
进行以下实验以确定CZ05菌株为何能在pH 3–12范围内生长。将多粘类芽孢杆菌CZ05接种于LB、1号和4号培养基中，测定培养基中pH的变化。如图2d所示，所有培养基中pH值先下降后上升。4号和LB培养基中最终稳定在约pH 8.5，1号培养基中稳定在6.5。CZ05菌株在生长过程中产生碱性物质。当培养基中添加有机物时，该菌株能产生更多碱性物质。这种特性可以提高酸性物质的溶解度，解释了为什么多粘类芽孢杆菌CZ05能在4号培养基的如此宽pH范围内生长。
所有这些结果表明，多粘类芽孢杆菌CZ05适用于生物滴滤池中去除沼气中的甲硫醇。
图2. 多粘类芽孢杆菌CZ05发酵过程特性。 （a）不同碳源的利用；（b）多粘类芽孢杆菌CZ05降解甲硫醇的批次培养，符号：1号（■）和4号（●）培养基中甲硫醇浓度；1号（□）和4号（○）培养基中OD600；（c）4号培养基中pH 3至12的生长情况；（d）LB、1号和4号培养基培养过程中pH的变化。
相关新闻推荐
2、生长曲线分析揭示：戈登氏链球菌通过ManL非特异性CCR机制抗衡致病菌（三）
3、O2/CO2主动自发气调对枝孢菌菌落形态、致病能力、生长曲线的影响（二）