3.2 RTP抑制紫色色杆菌026的紫色杆菌素产生
RTP对紫色色杆菌026的MIC值为1.8 mg/ml。我们选择亚MIC浓度的RTP，进一步通过分光光度法测定RTP对紫色色杆菌026紫色杆菌素产生的抗QS活性。如图3所示，随着RTP浓度的增加，紫色杆菌素产生逐渐减少。在定量分析中，RTP（浓度为1.20 mg/ml）使紫色色杆菌026的紫色杆菌素产生显著降低至87.56%的水平。为确保紫色杆菌素产生的抑制不是由于抗菌活性，进一步研究了RTP对紫色色杆菌026生长的影响。结果表明，低于1.2 mg/ml的RTP浓度对紫色色杆菌026的生长速率没有影响。
本数据与已有的发现一致，有研究者报道了含高浓度酚类化合物的某些香料对紫色色杆菌026紫色杆菌素产生的抑制达到约41%的水平。同样，其他研究者也证明多酚化合物如没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯和姜黄素可以干扰细菌QS。
图3 紫色色杆菌026在不同浓度RTP培养基中培养时的生物量和紫色杆菌素产生。数据以紫色杆菌素抑制百分比表示。每根柱代表所有重复的平均值和标准差。
3.3 RTP抑制大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的群游运动
RTP对大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的MIC分别为1.6 mg/ml和1.2 mg/ml。如表2所示，RTP以浓度依赖方式显著（P<0.05）抑制大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的QS依赖性群游迁移。当RTP浓度为640 mg/ml时，大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1群游迁移的抑制率分别为84.90%和78.03%。它在不抑制两种菌株生长的情况下抑制了群游运动（表2），从而证明RTP对群游的抑制不是由于抗菌作用。有趣的是，RTP抑制了铜绿假单胞菌PAO1的群游运动，但促进了其绿色色素的产生，这是一种QS控制的表型。
表2 大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1在不同浓度RTP下培养30 h后的迁移距离。结果以平均值±标准差表示。
| 菌株 | RTP浓度（mg/ml） | 群游直径（mm） | 相对于对照的群游运动降低（%） | 细胞活力测定（Log CFU/ml） |
|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌K-12 | 对照 | 81.79±1.87 | 0 | 8.50 |
| 大肠杆菌K-12 | 80 | 55.02±0.76 | 32.73 | 8.53 |
| 大肠杆菌K-12 | 160 | 35.96±1.36 | 56.03 | 8.51 |
| 大肠杆菌K-12 | 320 | 26.90±0.53 | 67.11 | 8.43 |
| 大肠杆菌K-12 | 640 | 12.35±2.18 | 84.90 | 8.48 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 对照 | 59.35±0.92 | 0 | 8.25 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 80 | 29.59±0.81 | 46.54 | 8.30 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 160 | 26.50±1.07 | 52.12 | 8.31 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 320 | 23.66±1.75 | 57.25 | 8.26 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 640 | 12.16±1.46 | 78.03 | 8.28 |
图4 （A）对照、（B）80 mg/ml、（C）160 mg/ml、（D）320 mg/ml和（E）640 mg/ml RTP对铜绿假单胞菌PAO1和大肠杆菌K-12迁移距离和色素产生的影响。
3.4 RTP抑制大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的生物膜形成
在生物膜生物量定量测定中，当细菌菌株在RTP存在下生长时，观察到生物膜形成显著（p<0.01）减少。在640 mg/ml浓度下，RTP对大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的生物膜生物量分别显示出最大67.02%和72.90%的减少（图5）。显然，RTP在不抑制其生物量的情况下抑制了受试菌株的生物膜形成。这证明RTP的生物膜抑制活性不是由于抗菌作用。
图5 不同浓度RTP存在下大肠杆菌K-12（A）和铜绿假单胞菌PAO1（B）生物膜的抑制。数据以生物膜抑制百分比表示。每根柱代表所有重复的平均值和标准差。
3.5 细菌生物膜的CLSM原位图像分析
CLSM z截面分析可以提供生物膜的表面覆盖率以及细菌生物膜的整个厚度。CLSM z截面分析显示，两种菌株（大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1）在没有RTP的情况下形成了厚而致密的生物膜。相反，640 mg/ml的亚MIC浓度RTP导致表面形成更薄、更松散的细胞聚集，而非正常的生物膜结构（图6）。共聚焦堆叠图像显示，在阴性对照组中，大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1形成的生物膜厚度分别为20.366±1.269 μm和27.924±1.105 μm。而当大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1与640 mg/ml RTP一起培养时，生物膜厚度分别降至8.130±1.033 μm和9.318±1.014 μm。
除了生物膜厚度的差异外，RTP还影响了覆盖的表面积。大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1生物膜的CLSM俯视图显示，对照组（不含RTP）的生物膜覆盖了整个盖玻片表面。但在含640 mg/ml RTP的测试组中，CLSM评估显示两种细菌的盖玻片表面覆盖率均明显降低，细菌密度显著降低。
QS机制影响细菌生物膜的启动和成熟。含640 mg/ml RTP的培养基有效降低了铜绿假单胞菌PAO1和大肠杆菌K-12等病原菌在生物膜形成过程中生物膜的厚度和微菌落的形成。这证明生物膜形成可能在附着阶段开始时就受到抑制。这与先前发表的报告一致。
图6 无RTP（A）和有RTP（640 mg/ml）存在下大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的CLSM图像。
4. 结论
在本研究中，我们首次证明了RTP（一种来自玫瑰花茶的多酚富集提取物）的抗生物膜和抗QS潜力，并鉴定了与抗QS活性相关的RTP成分。RTP显著抑制了紫色色杆菌026的QS依赖性紫色杆菌素产生，并以浓度依赖方式抑制了大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的群游迁移。它还在亚MIC浓度下显著抑制了体外生物膜形成。此外，我们想知道RTP与消毒剂或抗菌剂联合使用时是否能提高其抗菌效果。同时，RTP是否对其他食品腐败菌和致病菌具有抗生物膜活性，即RTP是特异性还是通用型QSI，以及RTP的抗生物膜机制，我们对此深感兴趣，将在后续研究中探讨。
致谢
本研究由国家自然科学基金（No.31371807和31201422）、国家高技术研究发展计划（No.2011AA100903和2013BAD18B01-4）以及江苏省高等学校优势学科建设工程资助项目共同资助。
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