研究简介
本论文主要对医院病原体嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)进行了研究,通过系统突变分析揭示了其组氨酸激酶基因在生物膜发育中的关键作用,特别是BfmAK系统对生物膜形成的调控机制。嗜麦芽窄食单胞菌是一种革兰氏阴性细菌,因其强大的生物膜形成能力和对多种抗生素的耐药性,成为医院中对免疫系统受损患者构成严重威胁的病原体。本研究在S.maltophilia基因组中注释了62个潜在的组氨酸激酶基因,并成功构建了51个突变体。通过表型特征分析,研究人员发现了一系列在细菌生长、游动性和生物膜发育方面存在缺陷的突变体。其中,BfmA-BfmK(Smlt4209-Smlt4208)双组分信号转导系统(TCS)被证实对生物膜形成具有关键调控作用。研究人员进一步通过染色质免疫沉淀(ChIP)实验和电泳迁移率变化分析(EMSA)实验,揭示了BfmA作为转录因子,直接结合bfmA-bfmK操纵子和acoT基因的启动子区域,并正向调控它们的转录。acoT基因编码一种酰基辅酶A硫酯酶,与生物膜发育密切相关。实验结果表明,acoT基因的缺失显著降低了生物膜的形成能力,而acoT基因的过表达可以部分恢复bfmA突变体的生物膜形成缺陷。本研究不仅为理解S.maltophilia的生物膜形成机制提供了重要的遗传信息,而且为开发针对这种细菌的新疗法或抗菌剂提供了潜在的分子靶点。通过深入了解BfmAK系统的功能和调控机制,未来的研究可以探索新的策略来对抗这种在医院环境中对患者构成严重威胁的病原体。
Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C自动化微生物生长曲线分析系统用于测量嗜麦芽寡养单胞菌及其突变体在NYG培养基中的生长情况。使用NYG培养基(5 g/L胰蛋白胨,3 g/L酵母提取物,20 g/L甘油,pH 7.0)。将嗜麦芽寡养单胞菌野生型菌株和各个突变体菌株从-80°C保存的甘油菌中复苏,接种到NYG培养基中,28°C预培养过夜。将预培养的菌液以1:100的比例接种到新鲜的NYG培养基中,使初始OD600值约为0.1。将Bioscreen C仪器预热至28°C,确保恒温条件。在Bioscreen C软件中设置测量参数,包括测量间隔时间(通常为15分钟)和测量时长为24小时。通过Bioscreen测试的生长曲线,研究人员发现某些突变体(如Smlt0882和Smlt1636)的生长速率显著低于野生型菌株,表明这些基因对细菌的生长有重要影响。研究人员通过Bioscreen C测量的生长曲线数据,评估生物膜形成能力,排除了生长速率差异对结果的干扰,确保生物膜形成能力的差异是由特定基因的功能引起的,而非生长速率的差异。
实验结果
在51个突变体中,研究人员发现9个突变体的生物膜形成能力显著下降,包括Smlt2324(ravS)和Smlt2234(rpfC)等。通过构建bfmA和bfmK的插入突变体和互补株,研究人员证实了BfmAK系统对生物膜形成的调控作用。BfmK具有自激酶活性,而BfmA作为转录因子,正向调控bfmA-bfmK操纵子和acoT基因的转录。通过染色质免疫沉淀(ChIP)实验,研究人员筛选出六个可能被BfmA结合的启动子区域。BfmAK系统是S.maltophilia中控制生物膜形成的TCS,BfmK具有自激酶活性,而BfmA作为转录因子,正向调控bfmA-bfmK操纵子和acoT基因的转录。BfmA不仅自调控其自身的表达,还通过调控acoT基因的表达参与生物膜的形成。acoT基因的缺失显著降低了生物膜的形成能力,而acoT基因的过表达可以部分恢复bfmA突变体的生物膜形成缺陷。为开发针对S.maltophilia的新疗法或抗菌剂提供了潜在的分子靶点。通过深入了解BfmAK系统的功能和调控机制,未来的研究可以探索新的策略来对抗这种在医院环境中对患者构成严重威胁的病原体。
图1、嗜麦芽寡养单胞菌ATCC 13637组氨酸激酶编码基因插入突变体的菌落形态及游动能力。(A)突变体在平板上的位置分布。列与行的顺序分别以数字和字母标示。(B)细菌菌株在NYG富营养平板(1.5%琼脂)上培养24小时(28℃)的形态特征。每株菌接种1微升培养物于平板。(C)细菌菌株在含0.1%琼脂的半固体NYG平板上的游动能力。采用牙签穿刺接种后,28℃培养12小时。
图2、嗜麦芽寡养单胞菌ATCC 13637组氨酸激酶基因突变体的生物膜发育情况。(A)各菌株生物膜水平的定量分析。采用结晶紫染色法对生物膜进行定量检测。(B)菌株生长曲线。生物膜定量前,使用96孔板测定细菌培养物在600 nm波长下的吸光度值(OD600)。(C)生物膜量与细菌生长(OD600)的比值。误差线代表标准偏差(n=8)。*表示与野生型菌株相比具有统计学显著差异(P<0.05,采用Student's t检验计算)。
图3、Smlt4208-Smlt4209基因座的操纵子结构及其在生物膜发育中的作用。(A)Smlt4204-Smlt 4209基因座的基因组定位。箭头表示基因及其转录方向,标注了基因名称,箭头周围标示了用于RT-PCR的引物(P1至P12)。(B)通过RT-PCR解析Smlt4204-Smlt4209基因座的操纵子结构。使用嗜麦芽寡养单胞菌ATCC 13637在NYG培养基中28℃过夜培养的总RNA,以随机引物反转录获得cDNA。RT表示以RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增;DNA表示以细菌总DNA为模板的阳性对照;-RT表示cDNA合成时未加入逆转录酶的阴性对照。(C)BfmA-BfmK系统的体外磷酸化分析。使用50μg BfmK反向膜囊泡和20μM可溶性BfmA蛋白。[γ-32P]ATP按所示时间加入反应体系,反应通过SDS上样缓冲液终止,样品经12%SDS-PAGE分离。Int.表示通过Quantity One软件估算的条带强度。(D)bfmK(Smlt4208)和bfmA(Smlt4209)调控嗜麦芽寡养单胞菌ATCC 13637的生物膜形成。采用结晶紫染色法通过OD590测定细菌生物膜量。误差棒表示标准偏差(n=8)。*表示P<0.01(Student's t检验)。WT:野生型菌株;IFD-bfmK和IFD-bfmA:bfmK和bfmA的框内缺失突变体;IFD-bfmK-bfmK和IFD-bfmA-bfmA:互补菌株。所有菌株(包括野生型)均含有相应的空白或重组pBBRMCS2载体。(E)各菌株在NYG富营养培养基中的生长曲线。
图4、BfmA调控自身操纵子及Smlt0800的转录。(A)染色质免疫共沉淀(ChIP)筛选BfmA结合序列。各菌株在NYG培养基中培养至OD600为0.4,通过ChIP收集BfmA结合的双链DNA。采用半定量PCR定量与BfmA共沉淀的DNA量。No:未标记菌株(IFD-bfmA-bfmA)的ChIP DNA样本;His6:His6标记菌株(IFD-bfmA-bfmA*)的ChIP DNA样本;Sample:使用ChIP DNA进行PCR扩增;Input:使用ChIP前从细胞裂解液提取的细菌DNA进行PCR扩增,作为上样对照。(B)候选基因转录水平的半定量RT-PCR分析。以嗜麦芽寡养单胞菌ATCC 13637总RNA反转录获得cDNA。-RT表示阴性对照,cDNA合成时未加入逆转录酶。所有测试菌株均含有pBBRMCS2载体以保证可比性。实验独立重复三次。(C)实时定量PCR检测BfmA调控基因的转录水平。以tmRNA扩增的cDNA作为内参。每次检测均设置生物学重复和技术重复。图示为一次代表性实验结果
图5、BfmA直接结合bfmA和acoT启动子区域并调控生物膜形成。电泳迁移率变动分析(EMSA)显示,BfmA可直接结合bfmA自身(A)和acoT(B)的启动子区域。实验使用4 fmol[γ-32P]ATP标记的bfmA和acoT启动子区域DNA序列。递增浓度的未标记探针(10-1000倍)作为竞争剂与BfmA蛋白结合。各图右侧黑色三角形标示BfmA-DNA结合复合物。(C)bfmA对acoT具有上位效应,共同参与生物膜形成。测定不同菌株的生物膜形成量:IFD-acoT为acoT框内缺失突变体;IFD-acoT-acoT和IFD-bfmA-acoT分别为携带Plac启动子控制的全长acoT基因的acoT和bfmA突变体。所有菌株(包括野生型)均含有相应空白或重组pBBRMCS2载体。
总结
革兰氏阴性菌嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)存在于多种生态位中。由于其强大的生物膜形成能力和对多种抗生素的耐药性,该菌已成为免疫系统受抑制或受损患者健康的严重威胁。除组氨酸激酶RpfC外,双组分信号转导系统(TCS)作为大多数细菌病原体使用的典型调控机制,在嗜麦芽寡养单胞菌中尚未通过实验研究。本研究在嗜麦芽寡养单胞菌基因组中注释了62个推定组氨酸激酶基因,并通过系统性插入失活成功获得了51个突变体。表型鉴定发现了一系列在细菌生长、游动能力和生物膜发育方面存在缺陷的突变体。通过遗传验证,确定了一个名为BfmA-BfmK(Smlt4209-Smlt4208)的TCS调控嗜麦芽寡养单胞菌生物膜形成。结合相互作用伙伴预测和染色质免疫沉淀筛选,鉴定了6个在体内被BfmA结合的候选启动子区域。Bioscreen C系统为本研究提供了精确的细菌生长数据,帮助研究人员评估突变体的生长特性,排除生长差异对表型分析的干扰,并为后续的分子机制研究提供了重要的数据支持。研究证明,BfmA作为转录因子直接结合bfmA-bfmK和Smlt0800(acoT)的启动子区域(后者编码与生物膜发育相关的酰基辅酶A硫酯酶),并正向调控它们的转录。组氨酸激酶基因的全基因组突变分析及BfmK-BfmA在生物膜中的功能解析,为深入研究嗜麦芽寡养单胞菌的细胞信号传导提供了遗传信息,有助于开发针对这一重要细菌病原体的新方法。
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