2.3.模拟
使用方程（1）分析T_{text{det}}检测时间分布对四个（或多或少随机的）变量N_0、N_{text{det}}、mu和lambda（其分布取决于N_0）的依赖性。模拟研究在Excel中进行，并使用 Risk（Microsoft ExcelTM的风险分析加载项，4.05专业版，Palisade，美国，2000）进行分析，输入如下：
•每孔初始细胞数遵循泊松分布，平均每孔1个细胞；
•单细胞的延滞时间lambda(1)假设为Gamma分布，遵循Baranyi和Pin（2001）的理论。Gamma函数由两个参数alpha和beta定义。在最佳生长条件下（30°C，pH 7，0.5%NaCl），alpha取5，beta=0.5小时，导致单细胞预期延滞时间平均值为2.5小时（注意2.5小时是单细胞延滞时间的平均值，与群体延滞期不同），标准差为1.12小时。当每孔有多个细胞时，延滞时间使用Baranyi和Pin（2001）推导的公式估算。使用与方程（1）相同的符号，
•比生长速率假设服从正态分布，平均值为1~h^{-1}，标准差为0.03~h^{-1}。这对应于约3%的相对偏差，这是通过生成独立重复的活菌计数生长曲线确定的。图2显示了其中四条曲线，来自在最佳条件下培养的培养物。在不太有利的环境条件下也生成了类似的曲线。它们表明最大比生长速率是一个重现性很好的参数，在支持生长的环境中误差范围为1-5%。
•检测水平细胞数的分布假设为均匀分布，介于5times 10^{6}和1.5times 10^{7}个细胞/ml之间。
3.结果与讨论
3.1.模拟
使用蒙特卡罗抽样方法进行一万次迭代，得到T_{text{det}}检测时间的标准差为1.25小时，而个体延滞时间的标准差为1.12~h。在方差分析（ANOVA）术语中，1.12^{2}/1.25^{2}=80%的检测时间方差可由延滞时间的方差解释。注意，在此模拟中，延滞时间变异性相对较小。如果细胞受到胁迫，其延滞时间将更加分散，个体延滞时间变异性对总体变异性的贡献将变得更加主导。
模拟的T_{text{det}}检测时间保持了Gamma分布的形状。 Risk中所有可用的分布（对数正态分布等）都拟合到T_{text{det}}值。Gamma分布给出了良好的拟合，卡方值高达93%。T_{text{det}}的方差略高于个体延滞时间的方差。
结论是Gamma分布适合拟合T_{text{det}}值的分布，并且检测时间的大部分变异性可归因于延滞时间的变异性。
模拟还表明，为了获得检测时间分布的良好估计，所需的阳性孔数约为100。
3.2.实验结果
Gamma分布被证明适合拟合测量的T_{text{det}}检测时间（图3）。这与Wu等（2000）的发现不一致，他们使用正态分布拟合个体细胞延滞时间的分布。然而，他们报告每次稀释有40个重复，根据我们的经验，这不足以确定哪种分布最佳。
在Bioscreen微孔板的200个孔中，阳性孔的平均数量始终在125到175之间。基于泊松假设，这意味着在所有实验中N_{0}的平均值在1到2之间。
我们已经确定检测时间变异性的主要来源是个体延滞时间的变异性。为了测试生长条件的影响是否一致，在每种环境条件下进行了两到三次重复实验。在给定环境条件下，检测时间的总方差被分为三个独立的方差：
sigma^2_{text{total}}=V_R+V_E+V_H
其中(i)V_R源于Bioscreen读数不准确性；(ii)V_E源于环境条件影响的变异性；(iii)V_H源于细胞接种时生理状态的异质性。这是通过检测时间分布测量的（其主要来源是个体延滞时间的变异性）。
Bioscreen读数不准确性V_R通过高水平接种实验评估，并假设在任何环境条件下相同。环境条件引起的变异性V_E是在相同条件下进行的实验中检测时间均值的方差。均值以检测时间的标准差加权。最后，群体异质性引起的变异性V_H是通过从给定环境条件下集合的平均总方差中减去前述方差得到的。结果以R^{2}百分比表示，即由于接种时细胞生理状态异质性引起的总变异性比例（表1）。在大多数情况下，环境条件的重复是令人满意的（群体异质性引起的变异性高于95%）。然而，对于在pH 5.0或5.5下进行的实验，情况并非如此；在这些低pH值下，结果无法一致地重复。
表1
不同环境条件下检测时间的变异性来源
主要来源通常是细胞初始生理状态的异质性V_H，除了在低pH值时，环境因素影响的变异性V_E可能具有同等权重。
正如预期，生长条件抑制性越强，检测时间越长，其分布越分散。在图4中，对于每种生长条件，检测时间的标准差对其平均值作图。可以看出，在所研究的环境因素区域内，检测时间的标准差与其平均值之间的关系大致是线性的。然而值得注意的是，在NaCl浓度为4%时，标准差几乎与0.5%时保持相同水平，然后才增加。这与Patchett等（1992）的结果一致，他们发现钾和甜菜碱等渗透保护剂的增加（随着NaCl浓度增加而在细胞中积累）从约5%的NaCl浓度开始显著增加。
4.结论
控制病原菌延滞时间的变异性对于生产安全食品（例如最小加工食品）是可取的。然而，从技术上讲，获取足够且足够准确的单个细胞延滞时间数据是困难的。浊度检测时间可能提供解决此问题的方法。正如我们所表明的，如果初始细胞数较低，检测时间变异性的主要来源接近于个体延滞时间的变异性。作为初步近似，可以在检测时间与其标准差之间建立线性关系dev(T)~T。然而，如果生长缓慢，那么其他来源（“噪声”）可能匹配原始变异性的比例，并且线性关系可能不易被观察/重现。
致谢
这项工作部分在食品研究所项目CSG 434.1213A下准备，部分由欧盟项目QoL 2000-01145（BACANOVA）资助。
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