摘要
研究了两株不产芽孢、与李斯特菌属成员相似的杆菌的系统发育位置和表型特征。这两株革兰氏阳性、轻微运动、兼性厌氧的菌株是从德国巴伐利亚州一个淡水池塘中采集的水生植物三棱叶（Lemna trisulca）中分离得到的。虽然使用API Listeria试剂盒无法鉴定，但16S rRNA序列分析证实其与洛氏李斯特菌（Listeria rocourtiae）DSM 22097^T^具有密切的系统发育相似性（序列相似性99.0%），而与其他李斯特菌属物种的关系较远（与单核细胞增生李斯特菌DSM 20600^T^为96.0%，与格氏李斯特菌DSM 20601^T^为95.0%）。分离株与洛氏李斯特菌DSM 22097^T^之间的DNA-DNA杂交分析显示相似性为22.5%。对sigB、prs、recA和HSP60部分序列的分析和比较，以及与李斯特菌属其他成员和热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）DSM 20171^T^的比较，支持了16S rRNA基因序列所指示的亲缘关系。所研究的分离株为非溶血性，未与人类或动物疾病相关。虽然结果表明这些菌株属于李斯特菌属，但与洛氏李斯特菌DSM 22097^T^在表型和基因型上的差异表明这些菌株代表一个新种，建议命名为薇氏李斯特菌（Listeria weihenstephanensis sp. nov.）；模式菌株为WS 4560^T^（=DSM 24698^T^=LMG 26374^T^），WS 4615（=DSM 24699=LMG 26375）为该种的第二个菌株。
引言
李斯特菌属成员广泛分布于许多不同的自然和城市环境中。李斯特菌属目前包括以下物种：单核细胞增生李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、威氏李斯特菌、格氏李斯特菌、玛氏李斯特菌和洛氏李斯特菌。李斯特菌属包括短小的革兰氏阳性、兼性厌氧杆菌，G+C含量低，不产芽孢。细胞无荚膜，在20-30°C培养时具有运动性。生长温度范围为0-45°C，pH范围为6-9。细胞可在添加高达10%（w/v）NaCl的营养肉汤中生长。李斯特菌属成员过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性。细胞壁含有内消旋二氨基庚二酸变异型A1c。在37°C培养时，主要脂肪酸为anteiso-C~17:0~和anteiso-C~15:0~。甲萘醌是唯一的呼吸醌，含有七个异戊二烯单位（MK-7）。
无害李斯特菌、威氏李斯特菌、格氏李斯特菌、玛氏李斯特菌和洛氏李斯特菌被认为是非致病性的，但单核细胞增生李斯特菌、伊氏李斯特菌和斯氏李斯特菌具有溶血性，并携带主要的李斯特菌毒力基因簇的变体。单核细胞增生李斯特菌被公认为严重的人类病原体，而伊氏李斯特菌主要引起动物牲畜疾病。斯氏李斯特菌尽管存在毒力基因同源物，也被认为是非致病性的。
迄今为止描述的李斯特菌属物种的表型特征非常相似，但最近被认识的洛氏李斯特菌具有一系列非典型的生化特性。在本报告中，描述了从水生植物三棱叶中分离的两株李斯特菌样杆菌的多相分类分析。这些植物采自德国巴伐利亚州普费芬霍芬区内的静水淡水池塘Postweiher。杆菌发现于三棱叶上，三棱叶属于天南星科（浮萍亚科），是单子叶植物的一个分支。两株菌株经过样品富集（24小时，30°C）在半弗雷泽肉汤中，并在PALCAM琼脂上划线后分离得到。
材料与方法
PALCAM琼脂平板在30°C培养48小时。选择后，菌株在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）上继代培养，并在有氧条件下培养（30°C，48小时）。所研究的两株分离株为WS 4560^T^和WS 4615。WS 4560^T^和WS 4615以及参考菌株（已知李斯特菌属成员的模式种和热杀索丝菌DSM 20171^T^）的维持培养条件为在TSA或BHI琼脂（Oxoid）上30°C培养48小时。菌株以半固体TSA悬浮液（含12%甘油）形式保存在-20°C。
对在BHI肉汤中30°C培养24小时的细胞进行形态学检查，使用相差显微镜观察。WS 4560^T^和WS 4615的细胞为杆状，末端圆钝，呈延长状（宽0.4-0.5 μm，长2.0-4.5 μm；见图S1）。未观察到荚膜或芽孢形成。
通过在TSA上划线并在5、15、22、27、30、37、42和45°C培养来确定生长温度范围。通过1-14天内可见单菌落的形成来评估生长情况。两株分离株在5-30°C均可生长。菌落直径为1.0-2.5 mm，半透明、光滑、白色、隆起，边缘略不规则，在斜透射光下呈白色至蓝白色。此外，在平板计数肉汤中振荡培养评估3°C下的生长情况。培养10天后观察到明显的浑浊。使用Microbiology Workstation Bioscreen C在BHI肉汤中24-40°C、以2°C为间隔培养24小时，确定两株菌株以及李斯特菌属所有物种模式菌株的最适生长温度。每种菌株进行五次平行测定，每30分钟测定一次600 nm处的光密度。根据生长曲线的指数区域（OD~600~最高至0.2）确定世代时间。由于文献中尚未报道此类数据，李斯特菌属所有成员模式菌株的结果在补充数据中给出（表S4和图S2）。WS 4560^T^和WS 4615的最适生长温度为28-34°C。
在15、22、30和37°C不同生长温度下，通过在含0.2%（w/v）琼脂的半固体穿刺BHI培养基（Oxoid）中培养5天来检查运动性。两株分离株在15-30°C均表现出微弱的运动性。
按照先前描述的方法，使用三种缓冲系统（pH 4.0-5.0，0.1 M柠檬酸/0.1 M柠檬酸钠；pH 6.0-8.0，1 M KH~2~PO~4~/1 M NaOH；pH 9.0-10.0，0.1 M NaHCO~3~/0.1 M Na~2~CO~3~）和NaOH及HCl调节pH，在无NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤中检查生长pH值。使用Microbiology Workstation Bioscreen C在30°C振荡培养24小时进行分析。两株分离株在pH 6-8均可生长，最适生长pH为7-8。
使用Microbiology Workstation Bioscreen C在含3.5、6.5、10.5、12.5、14.5、17.5和20.5%（w/v）NaCl的BHI肉汤（Oxoid）中测定WS 4560^T^和WS 4615的耐盐性。在30°C振荡培养72小时。两株分离株在含3.5% NaCl的营养肉汤中生长（倍增时间90-100分钟），在含6.5% NaCl的营养肉汤中也能生长（倍增时间22-23小时）。李斯特菌属成员模式菌株的结果见表S4和图S3。
使用含有厌氧催化剂的厌氧罐（Anaerocult A；Merck）按照制造商说明测定厌氧条件下的生长情况。两株分离株在30°C厌氧条件下48小时内形成小菌落（直径0.5-1.0 mm）。