3、讨论与结论
本研究广泛收集全国各地水样，以小肠结肠炎耶尔森氏菌CICC 10869为指示菌株，从浙江省宁波市北仑区路林市场下水道采集的表层水样中分离纯化了一株烈性噬菌体，可快速裂解宿主菌株，使浑浊的CICC 10869(1.5 h)、CICC 21669(2.5 h)和CMCC 52202(1.5 h)菌液裂解澄清。生物信息分析表明Yen-yong1非常新颖，代表以往未知的病毒进化谱系，丰富了噬菌体知识库。在Yen-yong1基因组中未发现毒力因子基因、耐药基因和溶原相关基因，从基因水平上显示其应用的生物安全性。
截至目前，公共数据库和文献中共公布了67株小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体(表3)，其中在国际病毒分类委员会(ICTV)的分类系统中有分类地位的有11株：分别属于有尾纲Caudoviricetes的Autographiviridae科(7株)、Straboviridae科(3株)和Demerecviridae科(1株)。其他未分类的56株小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体中，9株呈长尾病毒样(Siphovirus-like)形态，7株呈短尾病毒样(Podovirus-like)形态，29株呈肌尾病毒样(Myovirus-like)形态，11株形态未知。基因组最大的是262 391 bp(Yersinia phage phiR1-37)，最小的是34 966 bp(Yersinia phage YeP6)。
表3已公开的小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体
以往对于分离获得的小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体大多具有严格的属特异性或种特异性[41-46]。本研究使用8个不同科的65株供试菌来检测Yen-yong1的宿主范围。结果与以往的报道一致，Yen-yong1对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有严格的种特异性。这一特性使噬菌体只特异性地杀死靶标病原菌，对非目标菌株不会裂解。Yen-yong1在4株供试小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中可裂解3株，具有株广谱性，有利于噬菌体的应用。
Yen-yong1的暴发量(406.17 PFU/cell)大于以往报道的小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体KFS-YE(38 PFU/cell)[42]、phiYeO3-12(120 PFU/cell)[41]、PY100(120 PFU/cell)[46]等，显示其更强的增殖能力。
Yen-yong1对理化因子具有优良的耐受性。在宽泛的温度(-80-60℃)和pH范围(2.0-13.0)下保持高水平溶菌活性。小肠结肠炎耶尔森氏菌能在pH 4.2-9.0[7]和冷藏温度下存活[3,6]，而噬菌体Yen-yong1良好的理化耐受范围远超小肠结肠炎耶尔森氏菌，这为研发高效的小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体生物制剂奠定了基础。以往报道的一些小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体，如Yersinia phage vB_Yen_X1和Yersinia phage KFS-YE也具有良好的pH耐受性，但均不如Yen-yong1。Yen-yong1对恶劣环境具有良好的耐受性，在极酸环境(pH 2.0)下处理2 h后滴度高达1.02×109 PFU/mL，在极碱环境(pH 12.0和pH 13.0)下处理2 h后滴度分别为3.09×108 PFU/mL和2.19×105 PFU/mL。Yen-yong1在0-3%的盐浓度环境中能保持高溶菌活性(滴度>108 PFU/mL)，优良的理化性质为Yen-yong1的实际应用奠定了基础。CICC 10869在含5%以上盐浓度的平板上无法生长成可见菌苔，因而在噬菌体盐度敏感性实验中Yen-yong1无法形成可见噬菌斑，但这并不意味着Yen-yong1无法耐受5%以上的盐浓度，需要开展进一步研究以检测其高盐耐受性。
为了探讨噬菌体适用储存条件，开展了噬菌体在-80、-20、4℃的长期储存试验与在-80、-20℃的冻融实验。Yen-yong1的滴度在实验时间(0-360 d)内，-80℃或-20℃储存时滴度基本保持恒定，4℃储存时则缓慢下降；-80℃和-20℃储存并反复冻融后滴度略有下降，但均在108 PFU/mL以上。结果显示，分装冻存能更好地长期保持噬菌体的活性。
细菌生物被膜结构不仅能阻止药物渗透到生物被膜内部的细胞，还能抵抗宿主免疫系统，是细菌感染持续存在的主要原因之一[37]，是防治细菌感染需要解决的一个重要问题。本研究发现噬菌体Yen-yong1对小肠结肠炎耶尔森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生物被膜均具有破坏作用。噬菌斑周围具有半透明晕圈，半透明晕圈是由噬菌体解聚酶基因的编码产物造成的[21]。噬菌体解聚酶能降解细菌的基质结构，帮助病毒颗粒吸附、侵入和裂解宿主菌。即使在生物被膜中，解聚酶也能发挥很好的作用[47]。噬菌体解聚酶已经成为了预防和清除细菌生物被膜的一种潜在策略。虽然在Yen-yong1基因组中尚未发现已知的解聚酶基因，但实验验证了其解聚酶活性。如结果所述，Yen-yong1代表以往未知的进化谱系，其序列非常新颖，一些ORFs因现有数据库中无足够参考基因而尚无法被注释，其基因组中的解聚酶基因也很可能是新颖的，有待进一步研究。
本研究不仅分析了Yen-yong1在不同MOIs下对生猪肉片中小肠结肠炎耶尔森氏菌的清除效果，还分析了Yen-yong1对生猪肉片中不同宿主菌的清除作用。实验结果表明，在MOI=1-100时，MOI越高，Yen-yong1对细菌生长的抑制效果越好。Yen-yong1对猪肉中3株供试小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株显示出良好的除菌效果。
小肠结肠炎耶尔森氏菌具有耐冷性[6]，可在冷藏温度(4℃)下增殖，因此耶尔森氏菌病也被称为“冰箱病”。本研究发现，被试的小肠结肠炎耶尔森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202在冷藏温度下均可增殖，其中CMCC 52202的增殖能力尤为显著。在冷藏24 h后，猪肉中的菌量增加了2.47 log10单位(表2)。噬菌体在冷藏条件下是否具有抑菌能力，以及能力的强弱，对于小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体的可应用性至关重要。文献报道Yersinia phage fHe-Yen9-01在4℃、MOI=105时对生猪肉的细菌清除率可达90.78%[48]。相比之下，Yen-yong1在4℃下表现出更为优良的细菌清除力，在MOI=1、10和100时，对猪肉中CICC 10869的清除率分别高达91.21%、93.95%和98.28%；对CICC 21669和CMCC 52202的清除率分别为78.35%(MOI=100)和96.33%(MOI=100)。Yen-yong1的这一特性使其在冷藏条件下对食品的保护具有显著优势。首个获得FDA GRAS认证的单增李斯特菌噬菌体制剂Listex?P100，可作为食品添加剂应用于即食肉类和家禽产品。当用量达到1×109 PFU/cm2时，Listex?P100可将猪牛肉、禽肉和水产品中的单增李斯特菌清除减少1.3-3.4 log10单位。若将Listex?P100的剂量每减少一个数量级，则其对食品中细菌的清除幅度减少约0.5 log10单位[49]。在本研究中，噬菌体Yen-yong1的剂量为4×107 PFU/cm2时，可分别将猪肉中的小肠结肠炎耶尔森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202减少1.77、0.67和1.43 log10单位(表2)。在107 PFU/cm2剂量水平下，Yen-yong1的有效性并不逊于Listex?P100，显示出良好的开发应用潜力。后续研究计划将其剂量提高至1×108 PFU/cm2、1×109 PFU/cm2或更高，以检测其最佳抑菌剂量。
Yen-yong1在冷藏温度(4℃)下的清除率高于室温(25℃)(图8)，这可能是因为在室温(25℃)下，细菌的生理活动相对活跃，细胞膜流动性较好，细胞内酶活性较高，能够进行正常的代谢和防御活动，从而可能有更多的防御机制来抵抗噬菌体的感染，具体机制有待进一步研究。此外，为模拟猪肉在常温短时摆放出售和长时间冷藏运输、储存的实际情况，本研究在25℃下设定噬菌体的作用时间为3 h，而在4℃下则为24 h。噬菌体作用时间的延长也可能是冷藏温度下细菌清除率高于室温的原因之一。
噬菌体溶菌酶、裂解酶、穿孔素等溶菌相关蛋白的编码基因是对抗细菌的重要资源，其编码产物也被广泛认为是抗生素的理想替代品。Yen-yong1的基因组中有5个基因分别编码具有溶菌活性的穿孔素、裂解酶、溶菌酶和spanin，这些基因是潜在的可开发资源。此外，噬菌体编码的尾丝蛋白能特异性识别并结合宿主细菌表面的受体[50]，可作为细菌生物识别元件应用于病原菌的快速检测[51]。Yen-yong1基因组中还有许多功能未知的基因编码假设蛋白，它们也可能具有重要的功能和开发价值，如前文提到的解聚酶基因。为挖掘基因资源、揭示噬菌体与宿主细菌的关系，后续我们将陆续对这些未注释的基因进行表达与应用开发。
综上所述，本研究分离培养的Yen-yong1揭示了新的病毒进化谱系和丰富的基因资源；Yen-yong1可专性裂解多株小肠结肠炎耶尔森氏菌，且理化耐受性强，具有良好的应用前景。
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