摘要： 为研制猪粪微生物除臭剂，本试验以发酵猪粪为样本筛选除臭微生物并对其生长曲线进行测定，结果从发酵猪粪中分离得到4株具有除臭功能的菌株，经染色镜检和生化反应判定为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和班图酒香酵母菌，且这4株菌株的生长曲线各具特点。
随着畜牧养殖业的迅猛发展，畜禽养殖场对周边生态环境的污染问题日益凸显，尤其是畜禽粪便若缺乏科学合理的处置与资源化利用途径，极易造成场区周边恶臭弥漫、蚊蝇大量孳生，并进一步诱发各类动植物及人类疾病。因此，如何高效处理与合理利用畜禽粪便，特别是有效控制并减少其中恶臭气体的排放，已成为保障现代畜牧业可持续健康发展、维护区域生态平衡的关键抓手之一。在当前众多的粪便除臭处理技术中，微生物除臭法凭借其去除效率高、不产生二次污染、配套设备简易、操作便捷、成本低廉以及后期管护方便等显著优势，被视为一种极具应用前景的有效手段。已有文献指出，可从自然生态系统中分离获得具备高效除臭潜能的功能微生物。基于上述背景，本研究旨在从发酵猪粪中筛选具有优良除臭性能的目标微生物，并对其群体生长动态进行精确测定，以期为后续开发针对猪粪的微生物除臭制剂提供坚实的理论依据与菌种资源储备。
1 材料与方法
1.1 粪便样品
实验所用原料为采集自贵州大学示范种猪场的新鲜猪粪。
普通营养琼脂培养基、普通肉汤培养基、乳酸菌液体培养基以及酵母菌液体培养基均由本实验室自行配制；用于鉴定分析的生化管则购自杭州微生物试剂有限公司。
1.3 仪器设备
主要仪器包括：隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；光学显微镜（XTB-1型，江南电光公司）；水平层流双人超净工作台（CJ-525型，重庆无线专用设备厂）；电子天平（江苏常熟衡器厂）；恒温振荡摇床（上海一恒科技有限公司）；MOT400-NH₃氨气检测仪（深圳市恒兴宜科技有限公司）；MOT400-H₂S硫化氢检测仪（深圳市恒兴宜科技有限公司）；以及紫外可见分光光度计（UV-2000型，尤尼科上海仪器有限公司）。
1.4 微生物菌株的分离培养
称取适量新鲜猪粪样品，置于2000 mL三角烧瓶中，经充分发酵腐熟后，使用灭菌生理盐水将其稀释至10⁻¹悬液，随后连续进行10倍梯度的系列稀释。分别吸取不同稀释度的悬液500 μL，均匀涂布于普通营养琼脂培养基表面，在37℃条件下进行需氧或厌氧培养，历时3天。培养结束后，挑取呈现不同形态特征的菌落，经染色镜检鉴定后，再行纯培养以保藏备用。
1.5 除臭微生物菌株的筛选
将前述纯化的各株菌分别接入普通内汤培养基，于37℃、180 r/min振荡培养12小时，制备成种子液。随后按10%的接种量将培养菌液加入盛有300 g新鲜猪粪的2000 mL三角瓶中，封口密封，在室温条件下静置发酵15天。发酵期满后开瓶，通过感官评定初步判断各菌株对猪粪的除臭等级。另取纯培养菌液按10%接种量加入含300 g新鲜猪粪的2000 mL三角瓶中，充分混匀后密封，于室温静置发酵，并在不同时间点检测体系中氨气与硫化氢的含量变化，以此明确各菌株的实际除臭效果。每个处理设置3个生物学重复，同时以添加等量灭菌生理盐水的样品作为空白对照。
1.6 除臭微生物菌株的生化反应鉴定和生长曲线测定
选取除臭功能较优的菌株液体纯培养物，接种于系列生化鉴定管中以完成生理生化特性分析。同时，取 2 mL 菌液接入 100 mL 液体培养基中，在 37℃、180 r/min 条件下振荡培养，随后将培养物转移至 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪的专用微孔板中，每孔加入 200 μL 菌液，设置仪器自动每隔 1 小时测定一次 600 nm 波长下的光密度值（OD₆₀₀），连续监测 30 小时，由仪器自带软件自动绘制生长曲线。每个菌株设置 3 个重复孔，并以空白液体培养基作空白对照调零。
2 结果与分析
2.1 猪粪除臭微生物的分离与筛选结果
对发酵猪粪样本进行分离培养后，结合菌落形态学观察与菌体染色镜检，共计获得19株不同的微生物菌株。将这些菌株分别接种于猪粪中发酵15天后，依据感官指标评定其除臭等级，结果显示：19株菌中有4株（占比21.1%，即4/19）可达到1~2级的较好除臭效果。
将前期筛选出的4株具除臭效果的菌株（编号为JZ1~JZ4）分别接种到猪粪中进行发酵处理，于不同时间点检测氨气与硫化氢的释放量，具体测定数据见表1。
| 菌株 | 3 d NH₃ | 3 d H₂S | 6 d NH₃ | 6 d H₂S | 9 d NH₃ | 9 d H₂S | 12 d NH₃ | 12 d H₂S | 15 d NH₃ | 15 d H₂S |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| JZ-1 | 0.897 | 4.665 | 0.855 | 1.724 | 0.998 | 2.086 | 1.140 | 1.676 | 0.546 | 1.773 |
| JZ-2 | 0.869 | 3.226 | 0.622 | 1.632 | 1.300 | 1.599 | 1.168 | 1.627 | 0.688 | 1.724 |
| JZ-3 | 0.661 | 4.241 | 0.775 | 1.794 | 0.883 | 1.523 | 1.008 | 1.655 | 0.608 | 1.724 |
| JZ-4 | 0.861 | 2.687 | 0.989 | 1.066 | 1.048 | 1.285 | 0.767 | 1.316 | 0.463 | 0.865 |
| Control | 1.043 | 3.143 | 0.953 | 1.585 | 0.754 | 1.418 | 0.852 | 1.627 | 0.473 | 1.342 |
分析表1数据可知，以氨气和硫化氢为评判指标，不同微生物菌株对发酵猪粪的除臭表现存在明显差异。针对氨气，4株菌主要在发酵前期（6天以前）表现出去除效果；6天以后，各菌株对减少氨气释放基本不再具有明显作用。而对于硫化氢，4株菌中仅1株能在整个0~15天的发酵周期内持续发挥一定的去除作用，但整体去除效果随时间的推移呈逐渐衰减趋势。
2.2 猪粪除臭微生物菌株生化鉴定结果
分别取上述4株菌的纯培养物，接种于不同生化鉴定管，37℃恒温培养48~72小时后观察结果，见表2。
| 项目 | JZ-1 | JZ-2 | JZ-3 | JZ-4 |
|---|---|---|---|---|
| 乳酸 | - | - | + | - |
| 葡萄糖 | + | + | + | + |
| 麦芽糖 | + | - | + | - |
| 蔗糖 | - | + | + | - |
| 甘露糖 | - | + | + | - |
| 甘露醇 | - | + | + | + |
| 阿拉伯糖 | - | - | - | - |
| 木糖 | - | - | - | - |
| 果糖 | - | - | + | - |
| 棉子糖 | N | - | + | - |
| 山梨醇 | N | - | - | N |
| D-核糖 | N | N | + | + |
| 吲哚 | - | - | N | N |
| 硫化氢 | N | - | - | N |
| MR试验 | N | - | N | N |
| VP试验 | + | - | N | N |
| 孔雀石绿 | - | - | N | - |
| 硝酸盐 | + | + | - | - |
| 明胶酶 | + | + | - | N |
| 结果判定 | 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis | 短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus | 嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus | 班图酒香酵母菌 Brettanomyces custersianus |
结果判定 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus 嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus 班图酒香酵母菌 Brettanomyces custersianus
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“N”表示未测定。
2.3 猪粪除臭微生物菌株生长曲线测定结果
分别取 4 株菌的纯培养物 2 mL，接入 100 mL 液体培养基中，37℃、180 r/min 振荡培养后立即转移至 Bioscreen C 分析仪进行连续自动监测，仪器每 1 小时自动记录 OD₆₀₀ 值并生成生长曲线，结果见图 1。
从图中可见，4 种微生物呈现出各异的生长模式：枯草芽孢杆菌（JZ‑1）生长极为迅速，几乎检测不到明显的延滞期，很快便进入对数生长期（2～18 h），18～24 h 后转入稳定期，直至 30 h 观察结束仍未出现衰亡迹象；短小芽孢杆菌（JZ‑2）亦无显著延滞期，对数期为 2～16 h，稳定期约 16～20 h，20 h 后逐渐进入衰亡阶段；嗜酸乳杆菌（JZ‑3）则表现出较长的适应期（0～6 h），6 h 后开始对数增长（6～16 h），16 h 后进入稳定期，但生长速率始终较低，30 h 内未见衰亡；班图酒香酵母菌（JZ‑4）生长较为缓慢，延迟期同样为 0～6 h，12 h 后进入稳定生长期，整体增速接近于零，30 h 内亦无衰亡表现。
3 讨论
畜禽规模养殖所带来的环境污染，尤以粪便堆放释放的氨气等恶臭物质最为突出，这在行业集约化、规模化发展中已成为亟待解决的现实难题。目前针对畜禽粪便的除臭与控制虽方法多样，但微生物处理技术因其简便、高效而备受青睐。本试验通过分离培养与感官除臭等级评定，并结合氨气、硫化氢释放量的动态监测以及系统的生理生化鉴定，最终从发酵猪粪中成功筛选出4株除臭性能较好的微生物菌株，分别为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和班图酒香酵母菌，为后续微生物除臭剂的开发奠定了菌种基础。
在除臭剂研发过程中，掌握目标菌株的生长曲线对于确定最佳发酵液采集时机至关重要。本研究对4株菌进行了生长曲线测定，发现各自具有鲜明的动力学特征。通常，在工业微生物制剂生产中，多倾向于收集处于对数生长中后期至稳定期前段的菌液。因此，针对这4株菌，建议枯草芽孢杆菌的发酵液采集时间可安排在12~18 h之间。此外，将生长曲线与除臭效果（对氨气及硫化氢的去除）进行关联分析后发现，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌主要在猪粪发酵初期对减少氨气释放具有一定作用，而班图酒香酵母菌对硫化氢的去除效果相对持久，但二者之间的深层机理关联仍有待深入探究。
尽管本研究已获得4株具有除臭功能的菌株，但要将其真正研制成高效、稳定的微生物除臭剂，仍面临诸多挑战：首先，多菌株复配后是否存在相互拮抗而导致除臭效能下降尚不清楚；其次，猪粪发酵产生的恶臭气体除氨气和硫化氢外，还包含甲烷、二氧化硫、吲哚等多种成分，仅测定两项指标不足以全面评价除臭效果；再次，从自然环境中筛选的菌株对特定恶臭物的适应性与长期保存工艺需进一步优化；此外，恶臭气体去除率与发酵工艺参数之间的定量关系，以及混菌发酵的最佳工艺条件，均有待系统研究。即便如此，微生物除臭技术凭借其处理效率高、安全无二次污染、设备简单、费用低及运维方便等不可替代的优势，依然展现出广阔的应用前景与深远的发展潜力。