新发人畜共患病原马链球菌兽疫亚种在脑膜中的增殖，与猪的死亡及人类的发病密切相关。然而，高毒力兽疫链球菌为何具备在脑脊液（CSF）中大量增殖的惊人能力，其机制在很大程度上尚未阐明。本研究利用遗传条形码标记的马链球菌兽疫亚种发现，在小鼠全身性感染后，仅有约 1—10 个细菌克隆侵入脑膜，随后却在其中增殖约 10⁷ 倍。进一步的转座子插入测序实验，结合对细菌甘露糖磷酸转移酶系统（PTSman）缺陷株的验证工作，确认了负责摄取葡萄糖的 PTSman 是兽疫链球菌在脑脊液中增殖所必需的。兽疫链球菌的 PTSman 启动子赋予该系统物种特异性的组成型转录，使细菌能够在低葡萄糖浓度下获取葡萄糖，并限制严格应激反应的激活，从而实现病原体在脑脊液中的复制。
图1 、 人畜共患链球菌在脑脊液中增殖，并在大脑中达到高菌落形成单位（CFU）。a，尾静脉注射5×10⁶ CFU 人畜共患链球菌后各器官的菌落负担随时间变化情况。小鼠在29小时至39小时后出现死亡征象。b，C57BL/6J小鼠静脉注射5×10⁶ CFU SEZluc。左图：18小时后体内生物发光成像显示濒死小鼠脑内存在人畜共患链球菌及细菌积聚。中间图：生物发光信号的量化结果（每秒计数，cps）。右图：濒死小鼠安乐死后的器官生物发光图像（额外重复样本见扩展数据图1b）。c、d C57BL/6J小鼠静脉感染10⁶ CFU人畜共患链球菌，于濒死阶段采集脑组织和脑脊液，用于组织学免疫荧光或菌落计数。c，小鼠脑横断面的免疫荧光图像。细菌用抗-SzM单克隆抗体（绿色）标记，细胞核用DAPI染色。d，濒死小鼠脑脊液中的CFU负荷。
图2、使用条形码细菌分析人畜共患链球菌感染动态。a–c，分别在6小时（a）、18小时（b）和36小时（c）后尾静脉注射5×10⁶ CFU SEZSTAMP后从器官中回收的log10(CFU)和log10(Ns)（n = 10）。麻醉后使用戊巴比妥诱导麻醉，并对所有小鼠进行心脏灌注，以确保血液与其他器官之间有明确区分。d，GD热图显示了6小时、18小时和36小时时血液及各器官中的GD值。每个方块代表一只小鼠。脑部和血液中GD值较高，表明其细菌群落与其他器官及血液相比差异较小。每个时间点包含10只小鼠的数据。e，第36小时小鼠1的条形码频率分布。每种颜色的比例表示该器官内条形码的相对丰度。每种颜色代表一个条形码所占该器官总条形码的百分比。星号表示大脑中主要富集的条形码，与血液中的条形码不同。 。
图3、鉴定影响人畜共患链球菌在脑脊液中增殖的关键基因。a，SEZTn文库筛选流程的实验示意图。将从THB中提取1小时的SEZTn文库，通过立体定位装置直接注射至小鼠侧脑室，用于初步筛选。注射后从脑组织中获取的文库经处理，以备后续筛选轮次使用。三轮筛选的文库均来自指定为输出的脑组织。b，濒死小鼠器官和血液中的菌落数（CFU）。C57BL/6J小鼠通过尾静脉注射5×10⁶ CFU的WT、ΔmanY或CΔmanY菌株（采用Šídák多重比较法对log-transformed CFU进行两因素方差分析与WT对比）。c，使用数字小鼠立体定位仪器，将WT、ΔmanY和CΔmanY各以5×10⁶ CFU直接注射至小鼠侧脑室。12小时后计数脑组织和脑脊液中的菌落数（n = 4；采用Dunnett多重比较法对log-transformed CFU进行单因素方差分析与WT对比）。d，未感染小鼠（n = 2）和濒死小鼠脑切片的H&E染色。经静脉注射 WT 或 ΔmanY 基因型（n = 3）感染。左侧图示为低倍视野，黑色方框标出用于详细分析的区域：脑膜、脑室和嗅球。红色箭头表示出血，蓝色箭头突出中性粒细胞浸润。WT 表现明显的病理特征，如中性粒细胞浸润和出血；而 ΔmanY 则表现为轻度病理改变。右侧图示为上述小鼠脑切片的组织病理学评分汇总。e，C57BL/6J 小鼠在每12小时静脉注射200 μg青霉素后存活曲线。小鼠在第24小时起被静脉注射5 × 10⁶ CFU 的 WT 或 ΔmanY，随后开始给予青霉素或生理盐水（PBS）治疗。f，感染及青霉素治疗后，濒死与存活小鼠器官及血液中的CFU负荷。
图4、PTSman在低葡萄糖浓度下对葡萄糖的利用至关重要。a，WT、ΔmanY和CΔmanY在CDM中使用六种优选碳源时的生长曲线（n = 4）。b，通过测量在甲苯处理后的WT、ΔmanY和CΔmanY悬浮液中OD340处NADH的减少量，检测PTS特异性活性，使用五种碳水化合物作为CDM中的唯一碳源。c，WT在CDM中以生理浓度CSF碳水化合物培养时的生长曲线（n = 3）。d，小鼠脑脊液（CSF）中葡萄糖浓度（n = 8）：12小时、24小时、30小时及约36小时后（濒死期），经静脉注射5×10⁶ CFU WT感染。e，WT、ΔmanY和CΔmanY在CDM中处于静止相（培养12小时）时的CFU数量（n = 6），分别在0.2 g·L⁻¹、1 g·L⁻¹、2 g·L⁻¹和10 g·L⁻¹葡萄糖条件下。f，接种WT、ΔmanY和CΔmanY后，在CDM中0.2 g·L⁻¹、1 g·L⁻¹、2 g·L⁻¹和10 g·L⁻¹葡萄糖条件下残留葡萄糖的相对百分比（n = 3）。残留葡萄糖的百分比通过将特定时间点CDM中剩余的葡萄糖浓度除以初始葡萄糖浓度（0 h）来计算。 g，左侧：在猪脑脊液中体外培养的野生型（WT）、ΔmanY和CΔmanY的生长曲线（n = 3）。右侧：在体外接种野生型、ΔmanY和CΔmanY后，猪脑脊液中残留葡萄糖的相对百分比。h，野生型及所标示突变体在葡萄糖中的PTS特异性活性（n = 5）。
图5、PTSman启动子在低葡萄糖条件下赋予S. zooepidemicus生长优势。a–c，启动子活性的评估。a，从不同链球菌克隆出PmanX，并导入pTCV-lacZ载体中，分别转入野生型（WT）S. zooepidemicus或GBS A909菌株，以检测其转录活性（n = 3）。S. suis指猪链球菌，S. pneumoniae指肺炎链球菌。b，从manX上游截短片段克隆至pTCV-lacZ中，以鉴定潜在启动子区域（n = 3）。c，GAS和GCS来源的PmanX中−152至−104区段的核苷酸序列比对结果显示两个核苷酸突变（n = 6）。d，通过qRT-PCR检测WT和SEZ::PmanX(A909)菌株中相对manY转录水平，并以recA为标准进行归一化（n = 3）。e，WT、ΔmanY、CΔmanY及SEZ::PmanX(A909) 在含0.2 g L⁻¹、1 g L⁻¹、2 g L⁻¹和10 g L⁻¹葡萄糖的CDM培养基中的生长情况。f，WT、ΔmanY、CΔmanY和SEZ::PmanX(A909)在含0.2 g L⁻¹、1 g L⁻¹、2 g L⁻¹和10 g L⁻¹葡萄糖的CDM培养基中静止相（12小时）时的菌落形成单位（CFU），n = 3，数据采用Gompertz非线性回归模型拟合，随后进行单因素方差分析并使用Dunnett多重比较检验。g，将S. zooepidemicus或SEZ::PmanX(A909)静脉注射至C57BL/6J小鼠体内，从濒死小鼠的器官中计数CFU（n = 4；SEZ::PmanX(A909)感染小鼠于31小时至37小时后死亡。h，使用数字小鼠立体定位仪器将S. zooepidemicus或SEZ::PmanX(A909)以5 × 10⁶ CFU的量注入大脑侧脑室。n表示来自不同单个细菌克隆（a–f）或小鼠（g, h）的生物学重复样本。
总结
本研究结果揭示了兽疫链球菌代谢调控中 PTSman 的"重接"如何使该病原体适应脑脊液环境，并在脑膜炎期间于其中大量增殖。本论文中 BIOSCREEN C 全自动生长曲线分析仪承担的是"体外生长表型定量"这一关键验证角色，其应用贯穿方法学质控与核心机制验证两个层面，BIOSCREEN 全自动生长曲线分析仪负责 CDM 体系下的高通量连续监测。
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