研究简介
胰腺癌（PC）是全球第三大致死癌症，其五年生存率仅为9%至11%。尽管手术切除是目前最有效的治疗手段，但化疗药物如5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他滨（gemcitabine）在一定程度上可以改善患者的生存率。胰管内乳头状黏液性肿瘤（IPMNs）是胰腺囊性肿瘤，也是胰腺癌的重要前体病变。越来越多的证据表明，IPMNs中可能存在独特的肿瘤微生物组，但这些微生物的持久性及其对癌症治疗的潜在影响尚不清楚。本研究分析了来自临床IPMN样本的细菌分离株，并通过功能性实验和全基因组测序（WGS）研究了它们与化疗药物的相互作用。研究发现，大多数分离株能够降低5-FU和吉西他滨对胰腺癌细胞系（PANC-1、AsPC-1和Capan-2）的细胞毒性。WGS分析显示，与芽孢杆菌（Bacilli）相比，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）菌株在抗生素抗性、药物运输和毒力相关基因上更为丰富。进一步的通路分析表明，γ-变形菌纲在嘧啶代谢通路中更为丰富，而芽孢杆菌则在嘌呤代谢通路中更为丰富。这些发现表明，IPMN相关细菌具有代谢活性，能够调节化疗药物的疗效。研究发现IPMN相关细菌能够耐受两种常用的化疗药物5-FU和吉西他滨，并可能削弱它们对胰腺癌细胞的细胞毒性。通过全基因组和转录组分析，研究揭示了可能使这些细菌能够在肿瘤微环境中持续存在并代谢化疗药物的潜在适应机制。这些细菌的适应机制可能支持它们在肿瘤病变内的生存，并使它们能够与嘧啶类似物相互作用。这强调了阐明肿瘤相关微生物在调节肿瘤微环境和治疗中的功能角色的重要性。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen全自动生长曲线分析仪用于监测IPMN衍生细菌菌株的生长情况。从胰腺IPMN样本中分离得到的细菌菌株，经过纯化后在血平板上培养，挑选出单个菌落进行后续实验。将纯化的细菌菌落接种于5 mL液体脑心浸液（BHI）培养基中，在37℃、200 rpm的条件下振荡培养24小时。将培养好的菌液进一步稀释至OD为0.1的浓度，用于后续的生长曲线测定。取10μL稀释后的菌液（OD为0.1）与190μL BHI培养基混合，加入到Bioscreen C系统的100孔蜂窝板中，每个菌株设置3个重复孔。将蜂窝板放入Bioscreen C仪器中，在37℃下进行培养。仪器每隔15分钟自动测量一次菌液在600 nm处的吸光度（OD），以监测细菌的生长情况。根据吸光度（OD）随时间的变化，绘制细菌的生长曲线。通过生长曲线可以确定细菌的对数生长期、指数生长期和稳定期，并计算出每个菌株的倍增时间（DT）。
实验结果
胰腺肿瘤相关细菌对化疗药物的耐受性和代谢能力，揭示了这些细菌如何适应肿瘤微环境并影响化疗效果。研究发现，IPMN（胰管内乳头状黏液性肿瘤）衍生的细菌对5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他滨表现出不同程度的耐受性，其中多数菌株对吉西他滨敏感，但对5-FU频繁耐药。这些细菌还能代谢这两种化疗药物，减弱其对胰腺癌细胞的毒性，表明它们具有影响化疗效果的内在能力。通过全基因组测序（WGS）分析，研究发现γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）菌株比芽孢杆菌（Bacilli）菌株在功能上更丰富，尤其在能量代谢、膜运输等途径中。IPMN衍生细菌在嘧啶代谢途径中基因富集显著，可能帮助它们在肿瘤微环境中生存。研究还发现，不同恶性程度的IPMN衍生细菌菌株间存在大量共同基因，这些基因在嘧啶代谢、小分子代谢过程、DNA修复等途径中功能富集，表明这些细菌通过这些途径适应了IPMN环境。这些细菌的适应机制和代谢能力可能削弱化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果，促进肿瘤进展和化疗耐药性发展。
图1、IPMN衍生菌株对5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他滨的敏感性表征。A）IPMN衍生细菌菌株的分类、分离来源以及倍增时间（DT），以及对照菌株大肠杆菌（E.coli）d12和E.coli 25922。B）IPMN衍生细菌菌株和对照菌株的生长曲线。x轴表示时间（分钟），y轴表示在600 nm处的吸光度（OD）（平均值±标准差，n=3）。C）确定选定IPMN衍生菌株的半数抑制浓度（IC50）值的实验设计示意图，以E.coli d12、E.coli 25922和福赛坦菌（F.nucleatum）菌株作为对照。D）代表性剂量反应曲线，用于计算IPMN衍生的K.oxytoca（H1）在脑心浸液（BHI）培养基中孵育24小时后的IC50值。数据经过归一化、对数转换，并使用Gompertz方程拟合。E）热图显示了个别细菌菌株对5-FU和吉西他滨两倍稀释浓度的反应活性。活性以相对于未处理对照组（设定为100%）的存活率百分比表示（平均值±标准差，n=3）。左侧为5-FU，右侧为吉西他滨。
图2、IPMN衍生菌株代谢5-FU和吉西他滨，改变胰腺癌细胞对药物的敏感性。A）细菌降解化疗药物的实验设置示意图。5-FU和吉西他滨与个别细菌菌株一起孵育4小时。孵育后，通过0.2μm滤膜过滤上清液。通过CCK-8实验评估药物活性，并测试了4μM和40μM的指定药物浓度。以未处理的药物作为对照，计算相对药物活性。B-C：在与IPMN衍生菌株、E.coli和F.nucleatum共同孵育4小时后，PANC-1和AsPC-1细胞的存活率定量分析。化疗药物5-FU和吉西他滨（40μM）首先与IPMN衍生菌株一起孵育4小时，过滤、稀释后加入癌细胞培养中。细胞存活率在CCK-8实验中测量，并在48小时后以相对于未处理细胞的百分比存活率表示。D）热图总结了PANC-1、AsPC-1和Capan-2细胞系相对于活性药物处理的细胞存活率百分比增加情况。
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