摘要
在面团制作和烘焙过程之前，采用不同方式用焙烤酶处理麸皮，以增加添加麸皮的小麦面包中水溶性膳食纤维（DF）的含量。用胃肠道酶和溶剂沉淀法将可溶性膳食纤维从面包中用水提取，并与可消化物质分离。测试的焙烤酶混合物（木聚糖酶和葡聚糖酶/纤维素酶，含或不含脂肪酶）增加了可溶性阿拉伯木聚糖和抗消化蛋白质的含量。分离出的纤维被用作11株益生菌和肠道双歧杆菌菌株、脆弱拟杆菌和埃希氏大肠杆菌的共生菌株，以及大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和产气荚膜梭菌等潜在肠道致病菌株的生长底物。发酵分析表明，测试菌株在提取纤维存在下的生长能力各不相同。在测试的益生菌菌株中，长双歧杆菌种通常表现出最高的利用纤维提取物的能力，尽管测试的潜在致病菌也表现出在这些纤维提取物上生长的能力。总之，用于改善高纤维面包烘焙过程的酶也可用于原位生产可溶性纤维材料，进而对某些潜在有益菌发挥益生元作用。
麸皮是膳食纤维（DF）的丰富来源。它对小麦粉烘焙品质有强烈影响。随着麸皮含量增加，面包体积减小，面包颜色变深，并具有不同的质地和感官特性。酶长期以来被用于烘焙工业以改善面包品质，通过添加半纤维素修饰酶如木聚糖酶和纤维素酶，可以部分溶解麸皮的细胞壁成分，以提供更好的烘焙性能。
添加麸皮的面包是膳食中DF的重要来源，增加DF摄入被发现与许多健康益处相关，包括降低结直肠癌风险。就结直肠癌而言，预防作用被认为与DF的微生物发酵及短链脂肪酸（尤其是丁酸）在大肠中的形成有关。益生元低聚糖在小肠中既不被消化也不被吸收，选择性地促进结肠中有益微生物的生长和活性，可从麸皮DF中生产。阿拉伯木聚糖（AX）是小麦麸皮DF中主要的非淀粉碳水化合物成分，与其水溶性水解产物阿拉伯木低聚糖（AXOS）类似，已被发现具有益生元特性。麸皮DF和AX的很大一部分在水中不溶。通过使用细胞壁降解酶（如木聚糖酶）在烘焙过程中，可以增加可溶性AXOS和其他纤维成分的含量，进而促进结肠中潜在健康促进细菌的生长。这些碳水化合物的益生元效力可以通过已知健康促进细菌（如益生菌双歧杆菌）对它们进行厌氧发酵在体外进行评估。
本研究的目的是确定优化用于改善面包感官品质的焙烤酶混合物是否能产生具有益生元特性的可溶性纤维材料。为此，测试了两种不同的麸皮酶处理。与使用全麦粉不同，麸皮被分离并在面团制作和烘焙过程之前用半纤维素降解酶（如木聚糖酶、葡聚糖酶和纤维素酶）处理。可溶性纤维材料从面包中用水提取，并用胃肠道酶与可消化物质分离。分离出的纤维被用作12株益生菌和肠道细菌菌株以及2株共生细菌菌株的生长底物。为安全起见，在生长试验中还包括了大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和产气荚膜梭菌等潜在肠道致病菌株。
材料与方法
酶。 使用的所有酶均来自Genencor（丹麦布拉布兰德），Danisco分部。使用了两种酶组合：酶混合物1和酶混合物2。两种酶混合物的组成列于表1。
表1. 面包制作中的酶活性、酶产品及剂量，以及酶混合物1和酶混合物2的组成
| 酶活性 | 产品名称 | 酶混合物1（mg/kg） | 酶混合物2（mg/kg） |
|---|---|---|---|
| 木聚糖酶 | Grindamyl Powerbake 950 | 110 | 110 |
| 葡聚糖酶/纤维素酶 | Laminex GC220 | 110 | 110 |
| 脂肪酶 | Grindamyl Powerbake 4080 | 0 | 140 |
面粉。 商业小麦面粉及相应的碾磨麸皮组分由Valsemøllen（丹麦埃斯比约）提供。获得的组分及其商业碾磨的相对产率示于表2。根据相对产率，可以将各组分按正确比例混合以制备重构全麦粉，以及重构麸皮。
表2. 商业碾磨获得的组分及相对比例（%）
| 组分 | % |
|---|---|
| 小麦粉 | 80.7 |
| 粗麸皮 | 4.7 |
| 细麸皮 | 10.9 |
| 次粉 | 3.2 |
| 胚芽 | 0.5 |
面包制作过程。 采用标准程序制作面包。面团配方如下：重构全麦小麦粉2000克，干酵母30克，盐30克，蔗糖30克，水1420克。将原料在Diosna螺旋混合机（德国奥斯纳布吕克Diosna公司）中混合至27°C，然后在室温下静置10分钟。随后，将面团分切为750克的面包坯，在室温下再静置5分钟，成型，放入烤模中，在34°C下醒发55分钟。最后在200°C的辊式烤炉（德国阿恩施泰因Miwe公司）中烘烤30分钟。
在制作参考麸皮面包（面包1）时，使用上述工艺和原料。在制作预处理麸皮面包（面包2）时，将麸皮组分与配方中的水混合，在50°C下孵育3小时。然后将麸皮与其余面粉混合并制备面团。酶混合物1麸皮面包（面包3）的制作与面包2相同，但在预处理步骤中添加了酶混合物1。酶混合物2麸皮面包（面包4）的制作与面包3相同，但添加了酶混合物2。
从各种类型面包中提取和分离可溶性纤维。 用Moulinette D56研磨机（芬兰埃斯波Moulinex公司）配备不锈钢刀片将面包研磨。将10克研磨面包与125毫升去离子水混合，在22°C下振荡1小时。通过30000×g离心10分钟分离水相，并将上清液通过滤纸（Whatman 3，英国肯特Whatman公司）过滤。然后用水提取物处理胃肠道酶以降解可溶性淀粉和蛋白质。将10毫升0.2M磷酸钠缓冲液（pH 2.5）加入90毫升提取物中，用1M HCl将pH调至2.5。接着加入溶解在1毫升20mM HCl中的5毫克胃蛋白酶（Sigma P7000，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），在37°C下搅拌3小时。然后用1M NaOH将pH调至7，加入1毫升含有10毫克胰蛋白酶（Sigma P3292，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）和5毫克α-淀粉酶（Sigma A3176，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）的去离子水溶液。样品在37°C下搅拌3小时，并置于沸水浴中10分钟以沉淀蛋白质。30000×g离心10分钟后，向上清液中加入4体积的丙酮-乙醇（1:1）混合物，让纤维在+4°C下沉淀过夜。然后样品在30000×g下离心10分钟，弃去上清液。将固体残渣溶解在40毫升去离子水中，用4体积丙酮-乙醇（1:1）混合物在+4°C下重新沉淀过夜。30000×g离心10分钟后，弃去上清液，沉淀的可溶性纤维提取物在60°C下干燥5小时。
表3. 筛选中使用的细菌菌株
| 菌株 | 编号 |
|---|---|
| 长双歧杆菌 | DSM 20219 |
| 长双歧杆菌 Bl-05 | ATCC SD5588 |
| 长双歧杆菌 319 | Danisco |
| 长双歧杆菌亚种 婴儿双歧杆菌 | DSM 20088 |
| 乳双歧杆菌 Bl-04 | ATCC SD5219 |
| 乳双歧杆菌 420 | DSM 22089 |
| 角双歧杆菌 | DSM 20098 |
| 短双歧杆菌 | DSM 20213 |
| 短双歧杆菌 Bb-03 | ATCC SD5206 |
| 婴儿双歧杆菌 | ATCC 15697 |
| 链状双歧杆菌 | DSM 20103 |
| 嗜酸乳杆菌 NCFM | ATCC 700396 |
| 脆弱拟杆菌 | ATCC 25285 |
| 埃希氏大肠杆菌 | ATCC 11775 |
| 埃希氏大肠杆菌 O157:H7 | DSM |
| 鼠伤寒沙门氏菌 | EELA 4185/96 |
| 产气荚膜梭菌 | ATCC 13124 |
可溶性纤维提取物的糖组成。 将干燥的纤维提取物溶解在去离子水中（10至30毫克/毫升）。然后将0.1毫升溶液与0.1毫升2M H₂SO₄混合，在100°C下孵育3小时水解为单糖。将样品用水稀释至10毫升，通过Dionex HPLC系统（美国加利福尼亚州森尼韦尔Dionex公司）配备ED50脉冲电化学检测器（PED）、GP50泵和AS50进样器测定单糖组成（阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖）。使用CarboPac PA-1色谱柱（预柱4×50毫米，分析柱4×250毫米）和由水（A）与0.2M NaOH（B）混合物组成的流动相进行梯度洗脱分离单糖。梯度程序为：0–1.1分钟，A=90%；5–29分钟，A=100%；30–40分钟，A=0%；41–58分钟，A=90%。流速为1毫升/分钟，柱温30°C。在PED池前以0.6毫升/分钟的流速向柱流出液中加入0.3M NaOH溶液。单糖浓度通过外标法计算。酸水解纤维的组成单糖值使用适当的换算系数转换为相应的多糖值：戊糖为0.88，己糖为0.90。
可溶性纤维提取物中的蛋白质。 通过二喹啉甲酸法（BCA蛋白检测试剂盒，Pierce Chemical Co.，美国伊利诺伊州罗克福德）估计可溶性纤维提取物中的蛋白质浓度，以牛血清白蛋白为标准品。
益生菌、共生菌和致病菌株的制备。 在进行BioScreen测试之前，根据制造商说明，通过在de Man、Rogosa和Sharpe（MRS）肉汤（Lab 94，Lab M，英国兰开夏郡）中厌氧培养过夜至对数生长晚期来制备微生物预培养物。测试的菌株列于表3。它们包括商业益生菌、共生菌和致病菌株。每次测试都新鲜制备预培养物并进行洗涤。
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