NO杀死烧伤病灶中的白色念珠菌
通过检查真菌负荷进一步探索NO-np在感染组织中杀灭白色念珠菌的功效（图3）。感染后第3天和第7天，切除伤口并涂布在YPD琼脂上。与未治疗或np治疗的伤口相比，白色念珠菌感染的NO-np治疗烧伤显示出显著较低的真菌负荷（P<0.01；图3A）。
第7天未治疗和np治疗的白色念珠菌感染烧伤的H&E染色组织学检查显示，大量假菌丝和菌丝形态穿透不同组织层，伴有广泛的细胞坏死（图3B；插图）。NO-np治疗的白色念珠菌感染小鼠病灶的组织切片显示较少的化脓性炎症，伴有增加的纤维蛋白沉积，且真皮中没有真菌菌丝结构的证据（图3B）。
图3. NO-np在白色念珠菌诱导的烧伤感染中的抗真菌功效。（A）局部感染10⁷酵母细胞并用NO-np治疗的小鼠烧伤真菌负荷（菌落形成单位，CFU）显著低于未治疗或np治疗的小鼠（n=5）。柱状图为结果的平均值，括号表示标准差。星号表示P值显著性（P<0.05；P<0.001；ns，无显著性），通过方差分析计算并使用Bonferroni校正进行调整。（B）第7天未治疗白色念珠菌感染、np治疗白色念珠菌感染和NO-np治疗白色念珠菌感染的Balb/c小鼠的组织学分析。小鼠感染10⁷白色念珠菌。显示皮肤损伤的代表性H&E染色切片，插图显示白色念珠菌的过碘酸希夫染色。黑色箭头指示真菌假菌丝和菌丝。比例尺：20 μm。
NO-np减少生长和形态发生
使用延时显微镜检查NO-np是否干扰白色念珠菌细胞分裂和形态转化（图4A）。未处理的对照酵母显示快速（12分钟）出芽形成和形态发生。对照np延迟出芽和转化长达暴露后48分钟。相比之下，NO-np在整个检查的60分钟时间过程中抑制了真菌出芽和形态发生。在120分钟时间点，未处理组表现出与念珠菌假菌丝结构一致的形态变化，而np和NO-np处理组分别显示出延迟出芽或无出芽，没有任何活跃丝状化的迹象（图4B）。此外，NO-np处理的酵母显示出细胞水肿的特征性圆形，这在多重耐药金黄色葡萄球菌的研究中先前已有观察。因此，结果强烈表明NO-np可以有效抑制或延迟假菌丝形成的开始。综合这些结果表明，体内发现可能部分是由于酵母细胞分裂和形态发生速率的降低。
图4. NO-np对真菌生长和形态发生的影响。（A）使用延时（0-60分钟）显微镜探索NO-np对白色念珠菌细胞分裂和形态转化的影响。白色单箭头指示出芽酵母和/或假菌丝，而白色双箭头指示纳米颗粒聚集体。图像在40×下收集。比例尺：10 μm。（B）120分钟时未处理、np和NO-np组的延时显微镜图像。图像在40×下收集。比例尺：10 μm。（C）使用XTT还原测定法测量NO-np处理的丝状白色念珠菌在体外的代谢活性。100%活性设置为未添加NO-np或np的含丝状真菌孔中的测量值。柱状图代表结果的平均值，误差线表示标准差。星号表示P值显著性（P<0.001），通过方差分析计算并使用Bonferroni校正进行调整。这些实验进行了两次，结果相似。
由于白色念珠菌的丝状阶段侵入组织并与发病机制相关，我们研究了NO-np对真菌菌丝形态的抗真菌活性。使用XTT还原测定法量化真菌代谢活性。在24小时，与未处理（约65%；P<0.001）或np（约52%；P<0.001；图4C）相比，NO-np显著降低了丝状白色念珠菌的代谢活性。我们的发现表明，NO-np对白色念珠菌的组织侵袭性丝状形态有效。
NO-np加速烧伤愈合过程中念珠菌感染期间的胶原蛋白沉积和/或减少破坏
通过检查NO-np治疗烧伤伤口中的胶原蛋白含量，进一步探索NO-np加速伤口愈合的机制（图5）。三色染色将胶原蛋白染成蓝色。对于每个图像，使用Image J软件对20个相同大小的代表性方格中的胶原蛋白强度进行定量测量。NO-np治疗的感染伤口中胶原蛋白含量最高（图5A）。这些切片中分散的蓝色染色表明更厚、更成熟的组织胶原蛋白形成，因此表明NO-np暴露通过真菌清除保护了真皮结构，最终维持了胶原蛋白储存，同时促进了新胶原蛋白的形成。图5B是图5A所示数据的形态计量分析。
图5. NO-np对白色念珠菌烧伤感染中胶原蛋白降解的影响。（A）第7天未治疗白色念珠菌感染、np治疗白色念珠菌感染和NO-np治疗白色念珠菌感染的Balb/c小鼠的组织学分析。小鼠感染10⁷真菌细胞。蓝色染色指示胶原蛋白。比例尺：20 μm。（B）对未治疗白色念珠菌感染、np治疗白色念珠菌感染和NO-np治疗白色念珠菌感染的20个相同大小的代表性方格中胶原蛋白强度的定量测量。柱状图为结果的平均值，误差线表示标准差。星号表示P值显著性（P<0.05），通过方差分析计算并使用Bonferroni校正进行调整。
NO-np改变白色念珠菌烧伤感染中的白细胞浸润
我们研究了NO-np对白细胞迁移到白色念珠菌感染组织的影响（图6）。首先，通过测量损伤区域MPO的产生来评估中性粒细胞浸润。MPO是中性粒细胞中最丰富的酶，观察到的局部棕色染色反应表明，与未治疗或np治疗的烧伤组织相比，NO-np治疗样品中有更多的中性粒细胞浸润（图6A）。
其次，我们通过测量Iba-1的表达来鉴定巨噬细胞样浸润，Iba-1在这些细胞激活期间特异性表达和上调。Iba-1是Aif1基因（同种异体炎症因子1）的产物，位于主要组织相容性复合体III类区域的一个片段内。未治疗小鼠烧伤的切片仅显示散在的巨噬细胞样细胞，而np和NO-np治疗的小鼠在损伤区域显示大量细胞浸润（图6B）。
图6. NO-np对中性粒细胞和巨噬细胞样细胞浸润到烧伤伤口的影响。（A）第3天未治疗、np治疗和NO-np治疗受伤Balb/c小鼠的组织学分析。棕色染色指示中性粒细胞浸润。显示皮肤损伤的代表性MPO免疫染色切片。比例尺：20 μm。（B）第7天未治疗、np治疗和NO-np治疗受伤Balb/c小鼠的组织学分析。棕色染色指示巨噬细胞样细胞浸润。显示皮肤损伤的代表性Iba-1免疫染色切片。比例尺：25 μm。
综合这些数据表明，NO-np可以通过上调吞噬细胞浸润到损伤区域来刺激烧伤愈合和真菌细胞清除期间的细胞募集。