2.3. 生长曲线
在微孔板上进行生长实验。孔的填充方式与生物膜形成描述相同（10^4 cfu/mL）。在孵育前（0小时）和每隔2小时直到48小时监测细菌生长。使用Bioscreen C MBR全自动生长曲线分析仪（Oy Growth Curves Ab Ltd.）测量420-580 nm处的OD（OD420-580）。在测量浊度之前，将微孔板摇动一分钟。用于将生长曲线拟合到获得数据的模型是修正的Gompertz方程：ODt = A + B*exp(-exp(2.71828183*u*(L-t)/B + 1))，其中t = 自接种以来经过的时间（小时），ODt = 时间t处的光密度（在420-580 nm处测定），L = 延迟期结束时的延迟时间（小时），u = 达到的最大生长速率（ΔOD/h），B = 从接种到稳定期的OD420-580增加量（E），A = 上渐近曲线（稳定期细菌浓度，E）- B。达到稳定期的时间（T；小时）计算为达到等于或高于E值99%的浓度所经过的时间。
通过使用Marquardt算法将S形曲线拟合到数据集来获得每株菌株和重复的值，该算法计算给出最小残差平方和的参数值。使用决定系数（R²）评估拟合优度。使用方差分析技术比较L、u、E和T的统计显著性。使用Duncan多重范围检验获得均值分离。显著性水平确定为5%（P < 0.05）。
2.4. 校准曲线
进行校准方程以将光密度转换为平板计数。为此目的使用了五株菌株：4株来自家禽的分离物（鼠伤寒沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、婴儿沙门氏菌和肠炎沙门氏菌）和一株模式菌株（维尔乔沙门氏菌NCTC 574）。通过两种方式确定菌株的生长：通过在Bioscreen C MBR（Oy Growth Curves Ab Ltd.）中测量OD420-580，以及通过在平板计数琼脂（PCA，Oxoid Ltd.）中计数活细胞，使用0.1%（重量/体积）蛋白胨水（Oxoid Ltd.）进行十进制稀释，并在30°C下孵育48小时后计数可见菌落。包含未接种肉汤的空白样品孔作为污染对照。通过线性回归连续数据研究光密度与微生物计数之间的相关程度。本研究中的所有数据处理均使用Statistica 6.0软件包（Statsoft Ltd.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行。
3. 结果
3.1. 生物膜形成
所有测试的肠道沙门氏菌菌株均在聚苯乙烯微孔板上产生生物膜，OD580值范围从0.126±0.012到2.745±0.033。使用截止值（阴性对照平均OD以上三个标准差）0.118进行菌株分类。菌株被归类为弱（35株；平均OD580 = 0.185±0.049）、中等（22株；平均OD580 = 0.313±0.120）和强（12株；平均OD580 = 1.355±0.928）生物膜产生者。69株测试菌株的平均OD580为0.428±0.582。
生物膜形成受沙门氏菌血清型的显著影响，阿戈纳沙门氏菌（OD580 = 2.573±0.231）和伤寒沙门氏菌（1.158±0.098）显示比其他血清型显著（P < 0.001）更多的生物膜形成：0.389±0.246（鼠伤寒沙门氏菌）、0.337±0.053（纽波特沙门氏菌）、0.182±0.016（乙型副伤寒沙门氏菌）、0.230±0.129（浦那沙门氏菌）、0.227±0.075（德比沙门氏菌）、0.327±0.195（婴儿沙门氏菌）、0.260±0.176（肠炎沙门氏菌）和0.199±0.061（维尔乔沙门氏菌）（图1）。属于阿戈纳沙门氏菌和伤寒沙门氏菌血清型的所有菌株都是强生物膜产生者，而所有乙型副伤寒沙门氏菌和维尔乔沙门氏菌菌株被归类为弱生物膜产生者。测试的纽波特沙门氏菌菌株显示中等形成生物膜的能力。其余血清型中的菌株在形成生物膜的能力方面显示出更高的变异性，被归类为弱或中等生物膜产生者（浦那沙门氏菌和德比沙门氏菌），或被归类为弱、中等或强产生者（鼠伤寒沙门氏菌、婴儿沙门氏菌和肠炎沙门氏菌）（表1）。
图1. 不同肠沙门氏菌血清型的生物膜形成情况（580 nm处光密度值）。未出现共同字母的平均值之间存在显著差异（P < 0.05）。
表1 根据产生生物膜的能力对69株肠道沙门氏菌分离物的分类| 沙门氏菌血清型 | 弱 | 中等 | 强 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 数量 (%) | 平均OD580 ± 标准差 | 数量 (%) | 平均OD580 ± 标准差 | 数量 (%) | 平均OD580 ± 标准差 | |
| 鼠伤寒沙门氏菌 (n=4) | 1 (25.0) | 0.185±0.009 | 2 (50.0)* | 0.321±0.125 | 1 (25.0) | 0.730±0.203 |
| 纽波特沙门氏菌 (n=2) | 2 (100) | 0.337±0.053 | ||||
| 乙型副伤寒沙门氏菌 (n=3) | 3 (100)* | 0.182±0.016 | ||||
| 浦那沙门氏菌 (n=5) | 3 (60.0) | 0.182±0.016 | 2 (40.0) | 0.318±0.165 | ||
| 德比沙门氏菌 (n=2) | 1 (50.0) | 0.202±0.051 | 1 (50.0)* | 0.349±0.001 | ||
| 婴儿沙门氏菌 (n=7) | 2 (28.6) | 0.172±0.051 | 3 (42.9)* | 0.295±0.121 | 2 (28.6) | 0.525±0.209 |
| 肠炎沙门氏菌 (n=37) | 22 (59.5) | 0.185±0.052 | 12 (32.4)* | 0.309±0.125 | 3 (8.1) | 0.624±0.361 |
| 维尔乔沙门氏菌 (n=3) | 3 (100)* | 0.199±0.061 | ||||
| 阿戈纳沙门氏菌 (n=4) | 4 (100)* | 2.573±0.231 | ||||
| 伤寒沙门氏菌 (n=2) | 2 (100)* | 1.158±0.098 | ||||
| OD580，580 nm处的光密度；STD，标准差。每株菌株进行三次重复。*一株培养物保藏中心菌株。 | ||||||
3.2. 生长动力学参数
包括重复在内，共为测试的肠道沙门氏菌菌株生成了207条OD420-580曲线，并拟合到修正的Gompertz方程。估计的生长动力学参数显示在表2中。图2显示了十种肠道沙门氏菌血清型在TSB中的比较生长曲线。Gompertz模型拟合的R²值很高（>0.91）。
图2. 不同肠道沙门氏菌血清型菌株在胰蛋白胨大豆肉汤中的生长曲线
生长参数值在不同血清型之间有所变化。延迟期（小时）范围从-2.122±2.697（肠炎沙门氏菌）到4.165±0.260（阿戈纳沙门氏菌）。最大生长速率由阿戈纳沙门氏菌获得（0.114±0.011），其次是婴儿沙门氏菌（0.090±0.016）、德比沙门氏菌（0.084±0.024）和乙型副伤寒沙门氏菌（0.082±0.003）。上述四种血清型中的菌株显示最高的ODmax（最大OD420-580），并且属于T（达到稳定期的时间）最低的菌株。另一方面，伤寒沙门氏菌显示最低的u和ODmax，以及最高的T。在不同血清型之间观察到OD24（24小时测定的OD420-580；在此时评估生物膜形成）的显著差异，乙型副伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、维尔乔沙门氏菌和阿戈纳沙门氏菌显示最高值，伤寒沙门氏菌最低。
图3显示了微生物计数（log10 cfu/mL）与OD420-580值之间获得的回归方程和相关系数。发现在7.5-10 log10 cfu/mL范围内，微生物计数与光密度呈线性关系。在此范围内获得R²值为0.906。该方程用于估计24小时孵育后的微生物计数（确定生物膜形成的时间）和稳定期的最大细菌浓度。因此，根据该方程将实验期间获得的OD24h和ODmax值转换为微生物计数。24小时后记录的微生物计数（log10 cfu/mL）和最大微生物计数显示在表2中。
图3. 69株肠沙门氏菌菌株的微生物计数与OD420/e580值之间的关系
表2 69株肠道沙门氏菌的生长动力学参数| 血清型 | L (h) | u (ΔOD/h) | OD24h | ODmax | T (h) |
|---|---|---|---|---|---|
| 鼠伤寒沙门氏菌 (n=4) | 1.185±2.260a | 0.064±0.016ab | 1.017±0.122a (9.376±0.204a)* | 1.149±0.084a (9.596±0.140a) | 36.083±4.889ab |
| 纽波特沙门氏菌 (n=2) | 0.581±0.979ab | 0.061±0.005a | 1.050±0.016a (9.431±0.026a) | 1.159±0.027ab (9.613±0.045ab) | 40.167±4.665ac |
| 乙型副伤寒沙门氏菌 (n=3) | 2.186±0.372ac | 0.082±0.003c | 1.182±0.035bc (9.651±0.059bc) | 1.236±0.052cd (9.741±0.086cd) | 32.889±3.060b |
| 浦那沙门氏菌 (n=5) | -1.588±4.304bd | 0.064±0.007ab | 1.066±0.079a (9.458±0.131a) | 1.185±0.074ac (9.657±0.124ac) | 41.933±4.862cd |
| 德比沙门氏菌 (n=2) | 1.649±2.034ac | 0.084±0.024c | 1.156±0.108b (9.619±0.180b) | 1.221±0.068cd (9.716±0.113cd) | 33.667±7.554b |
| 婴儿沙门氏菌 (n=7) | 1.969±4.358ac | 0.090±0.016c | 1.194±0.091bc (9.671±0.151bc) | 1.252±0.045d (9.768±0.074d) | 31.714±6.944b |
| 肠炎沙门氏菌 (n=37) | -2.122±2.697d | 0.058±0.006a | 1.042±0.048a (9.418±0.079a) | 1.210±0.062bcd (9.697±0.103bcd) | 45.055±4.016de |
| 维尔乔沙门氏菌 (n=3) | 1.557±0.838ac | 0.071±0.005b | 1.135±0.024b (9.573±0.039b) | 1.222±0.035cd (9.717±0.058cd) | 35.444±5.028b |
| 阿戈纳沙门氏菌 (n=4) | 4.165±0.260c | 0.114±0.011d | 1.221±0.043c (9.717±0.071c) | 1.237±0.046cd (9.743±0.077cd) | 26.917±6.908f |
| 伤寒沙门氏菌 (n=2) | -1.996±2.215d | 0.030±0.002e | 0.675±0.045d (8.784±0.108d) | 0.969±0.101e (9.317±0.154e) | 47.714±0.756e |
| L，延迟期（h）；u，最大生长速率（ΔOD/h）；ODmax，最大光密度（在420-580 nm处测定）；OD24h，24小时后的光密度（在420-580 nm处测定）；T，达到稳定期的时间（h）。每株菌株进行三次重复；*括号中的数据对应于根据获得的回归方程将OD420-580转换为log10 cfu/mL。同一列中没有共同字母的均值显著不同（P < 0.05）。 | |||||
3.3. 生物膜形成与生长动力学参数之间的关系
沙门氏菌生物膜形成与生长动力学参数之间的相关性，包括延迟期（L；小时）、最大生长速率（u；ΔOD/h）、在420-580 nm处测定的最大光密度（ODmax）、24小时的光密度（OD24h）和达到稳定期的时间（T），显示在表3中。在L、u和OD24h之间观察到强相关性（>0.700；P < 0.001）。在上述三个参数和T之间获得强负相关性（从-0.500到-0.860；P < 0.001）。生物膜形成量与L（0.343；P < 0.01）、u（0.514；P < 0.001）、OD24h（0.351；P < 0.001）和T（-0.390；P < 0.001）显著相关。
图4. 基于69株肠沙门氏菌菌株的24小时光密度值（培养24小时后的OD420e580）及其最大生长速率（DOD420e580/小时），展示其在微孔板结晶紫法培养基中培养24小时后的生物膜形成情况（OD580值）。
绘制散点图以显示生物膜形成、u和OD24h之间的关系（图4）。可以看出，属于两种血清型（阿戈纳沙门氏菌和伤寒沙门氏菌）的细胞显示出与其余血清型菌株明显不同的行为。为了排除血清型可能是混杂变量的可能性，还评估了每种血清型菌株中生物膜产生与生长参数之间的关系。在该分析中，未观察到显著相关性，表明生物膜产生与生长参数之间的相关性是由于血清型的影响。
表3 69株肠道沙门氏菌菌株生长动力学参数与生物膜形成之间的相关系数
| u | ODmax | OD24h | T | 生物膜 | |
|---|---|---|---|---|---|
| L | 0.760*** | 0.249* | 0.740*** | -0.750*** | 0.343** |
| u | 0.422*** | 0.782*** | -0.860*** | 0.514*** | |
| ODmax | 0.624*** | -0.170 | -0.020 | ||
| OD24h | -0.500*** | 0.351*** | |||
| T | -0.390*** | ||||
| L，延迟期（h）；u，最大生长速率（ΔOD/h）；ODmax，最大光密度（在420-580 nm处测定）；OD24h，24小时后的光密度（在420-580 nm处测定）；T，达到稳定期的时间（h）；生物膜，生物膜形成（使用微孔板结晶紫法测定的OD580）。***，P < 0.001；**，P < 0.01；*，P < 0.05；无星号，不显著。 | |||||
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