酶活性测定和中间体鉴定
PCMH H6-PchF/PchC-H6对底物对甲苯酚和2,4-二甲苯的酶活性测定如前所述。对于H6-PchF/PchC-H6催化2,4-二甲苯反应产物的鉴定，设置1.5 ml反应混合物于50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0）中含0.33 mM 2,4-二甲苯、0.67 mM吩嗪硫酸甲酯、0.1 mM 2,6-二氯酚靛酚和147 μg H6-PchF/PchC-H6。从反应中取样的样品通过高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱（HPLC-DAD/MS）分析。
HPLC-DAD/MS分析在Dionex UltiMate 3000 RS HPLC系统与自动进样器和DAD检测器，以及配备电喷雾电离源的LCQ FleetTM离子阱质谱仪上进行。色谱分离在Hypersil GOLD aQ柱（150×2.1 mm，3 μm粒径）上使用梯度洗脱进行。二元流动相由溶剂A（水中0.1%乙酸）和B（乙腈）组成：0至0.5分钟13% B；0.5至0.6分钟增加至20% B，0.6至4.0分钟增加至30% B，4.0至4.1分钟增加至60% B，4.1至8.0分钟保持60% B，然后0.1分钟内回到13% B并平衡1.9分钟；流速0.3 ml/min。柱温和样品盘维持在30°C。进样体积15μl，DAD检测波长范围200-300 nm以监测紫外吸收。质谱仪在负离子模式和全扫描（50-300 m/z）下操作。样品溶液使用氮气作为鞘气和辅助气体，流速分别为35和5 arb（1 arb=0.3 l/min），进行雾化和蒸发。离子喷雾电压和传输毛细管电压分别设为5.0 kV和-45 V。传输毛细管温度维持在300°C。
PHBDD PchA-H6对底物4-羟基苯甲醛和4-羟基-3-甲基苯甲醛在辅因子NAD+或NADP+（钠盐）存在下的酶活性测定如前所述修改进行。反应混合物（最终体积1.0 ml）含40 mM HEPES-KOH缓冲液（pH 8.0）、50 μM NAD+或NADP+、50 μM 4-羟基苯甲醛或4-羟基-3-甲基苯甲醛和1.3μg酶（NADP+为辅因子）或104 μg酶（NAD+为辅因子）。参考比色杯含所有这些化合物 except 底物， assay 通过添加底物启动。PchA-H6催化4-羟基苯甲醛和4-羟基-3-甲基苯甲醛转化过程中340 nm的分光光度变化通过Lambda 25 UV/VIS光谱仪监测。底物和产物通过HPLC-DAD/MS与标准的保留时间、紫外光谱和质谱比较确认。对于HPLC-DAD/MS分析，反应混合物体积扩大至20 ml。
在PHBDD动力学测定中，进行四组独立实验，底物浓度范围从2到80 μM，辅因子浓度固定为100 μM。数据通过OriginPro 8软件用米氏方程拟合。蛋白质浓度通过Bradford法以牛血清白蛋白为标准测定。一单位酶活性定义为30°C下每分钟催化还原1 μmol NADP+或NAD+的酶量。比活性表示为每毫克蛋白质的单位。
基因敲除和互补
用于基因敲除的pEX18Tc-pchA和pEX18Tc-pchF通过将卡那霉素抗性基因和靶基因上下游两个片段的PCR产物与SacI/HindIII消化的pEX18Tc融合，使用In-Fusion® HD克隆试剂盒构建。这两个所得质粒转化到大肠杆菌WM3064（2,6-二氨基庚二酸营养缺陷型）后，通过接合转移到菌株9866。9866△pchA和9866△pchF的双交换重组子在含10%蔗糖（w/v）、氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上筛选。
用于基因互补的pRK415-pchA和pRK415-pchF通过将pchA和pchF的PCR产物与HindIII和EcoRI消化的pRK415融合构建。它们转化到大肠杆菌WM3064后，通过接合到pchA和pchF缺失菌株9866中获得9866△pchA[pRK415-pchA]和9866△pchF[pRK415-pchF]。
细菌生长测量
菌株9866及其衍生物以1.0 mM各碳源生长的OD600在自动浊度计Bioscreen C中测量。获取的数据转换为相应的细胞干重生物量。然后，生长曲线通过修改的Gompertz方程用OriginPro 8软件拟合，并计算其最大比生长速率（μm，每小时）。
菌株9866及其突变体对不同底物的生物转化
菌株9866及其突变体在2 mM葡萄糖中培养至OD600为0.1，然后用2 mM 2,4-二甲苯和对甲苯酚诱导5小时，之后进行4-羟基-3-甲基苯甲醛和4-羟基苯甲醛的生物转化。细胞通过4,500×g离心1.0分钟收获，洗涤两次，用最小培养基稀释至OD600为0.3，然后不同底物添加到每10 ml悬浮细胞中至终浓度1 mM。每10分钟从每个反应取0.5 ml样品，与0.5 ml乙腈混合，剧烈涡旋3分钟以停止反应。样品然后在14,500×g离心10分钟，收集上清液进行定量分析。
分析在Agilent 1200 HPLC系统上进行，配备可变波长检测器和Agilent ZORBAX 300SB-C18柱（250×4.6 mm，5μm粒径）。流动相由溶剂A（水中0.1%乙酸）和B（乙腈）组成。梯度程序从10% B开始，0至11分钟增加至30% B，11至16分钟增加至70% B，16至17分钟保持70% B，然后0.1分钟内回到10% B并平衡2.9分钟。流速1.0 ml/min。柱温30°C。进样体积20μl，检测波长250 nm。在此条件下，4-羟基-3-甲基苯甲醛、4-羟基-3-甲基苯甲酸、4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸的保留时间分别为11.0、8.7、7.4和5.9分钟。一单位活性定义为30°C下每分钟转化1 μmol底物所需的细胞量（毫克细胞干重）。
基因组步移
基因组步移进行以克隆质粒pRA4000中5,276-bp DNA序列侧翼区域，方法如前所述。本研究获得的核苷酸序列GenBank登录号为KC762703。
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