2.7. 碳水化合物
测试了四种具有益生元特性的商业可用碳水化合物增强开菲尔乳杆菌B6生长和/或活性的能力。这些包括两种基于果糖的聚合物：低聚果糖（FOS；Raftilose®P95，比利时Beneo-Orafti：93.2% FOS，聚合度2-8）和菊粉（Synergy 1；Beneo-Orafti：92%菊粉，聚合度2-8）、低聚半乳糖（GOS；Vivinal®，荷兰FrieslandCampina Domo：59%低聚糖、19%葡萄糖、21%乳糖、1%半乳糖）和二糖乳果糖（TCI；日本东京化学工业株式会社）。葡萄糖用作对照。除GOS为糖浆外，所有益生元均以粉末形式接收。使用前用蒸馏水适当稀释，过滤灭菌，4°C保存最多五天。
2.8. 不同碳水化合物的生长速率测定
每种细菌菌株划线到开菲尔乳杆菌B6的MRS琼脂平板和大肠杆菌及单核细胞增生李斯特菌的Wilkins-Chalgren琼脂（WC）平板上，37°C培养48小时。从每个平板取一个菌落用于接种9 mL无菌（121°C 15分钟）蛋白胨-酵母提取物肉汤（PY；pH 7.2）。PY肉汤包含：5 g蛋白胨水、5 g胰蛋白胨、10 g酵母提取物、40 mL盐溶液和0.2 mL维生素K1溶液。将1 mL 10%（w/v）适当过滤灭菌碳水化合物溶液等分试样添加到每种肉汤中，37°C培养24小时。然后取200 mL培养物等分试样转移到18 mL含2 mL各碳水化合物10%（w/v）溶液的无菌PY肉汤中，在相同条件下置于摇床培养箱中。在特定时间点（0、2、3、4、5、6、8和24小时）取1 mL等分试样，通过每个样品在660 nm处的光密度测量跟踪生长。
2.9. 合生素的抗菌活性
细菌菌株如上所述制备。将100 mL开菲尔乳杆菌B6和每种病原体（大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌）分别转移到100 mL含1%（w/v）测试碳水化合物的PY肉汤中，37°C摇床培养24小时。在24小时期间特定时间点（0、4、8、12、24小时）通过涂布到选择性琼脂上监测生长。取1 mL等分试样在q-s林格溶液中系列稀释。100 mL涂布到开菲尔乳杆菌B6的MRS琼脂、大肠杆菌的山梨醇麦康凯琼脂和单核细胞增生李斯特菌的牛津李斯特菌选择性琼脂上。作为对照，100 mL每种病原体用于接种90 mL含10 mL各过滤灭菌碳水化合物10%（w/v）溶液的无菌PY肉汤，在相同条件下保存。所有平板在37°C培养，MRS和牛津李斯特菌选择性琼脂培养48小时，山梨醇麦康凯培养24小时。在每个时间点从每个样品取1 mL等分试样用于pH测量。使用相同方法进行额外实验，但向PY肉汤中添加葡萄糖和乳糖的混合物，最终浓度各为0.2%。
2.10. 开菲尔乳杆菌在不同碳水化合物上的额外生长测定
为了确定开菲尔乳杆菌B6利用一些额外碳水化合物的能力，将接种（100 mL）过夜开菲尔乳杆菌B6 PY肉汤培养物的10 mL补充各种碳水化合物的PY肉汤等分试样，37°C培养48小时。通过涂布到MRSA上并在37°C培养48小时后计数菌落，确定初始接种物和补充碳水化合物肉汤的活菌数。添加的碳水化合物见表1。
表1 在添加不同碳水化合物的PY培养基中于37°C培养18小时后，开菲尔乳杆菌B6的活菌计数：
a 不添加碳水化合物时开菲尔乳杆菌活菌计数（log cfu/mL）：
无添加时为5.3（1.6）；
添加1%葡萄糖（w/v）时为7.5（3.8）；
添加1%乳糖（w/v）时为6.4（2.7）；
添加1%半乳糖（w/v）时为7.3（3.6）；
GOS污染物*为7.2（3.5）；
添加1% GOS（w/v）时为7.4（3.8）。
括号内数值表示从零时刻起（初始接种量为3.6 log cfu/mL）的活菌计数增长值。培养18小时时的GOS污染物包括：0.2%葡萄糖（w/v）þ 0.2%乳糖（w/v），该含量与含1% GOS糖浆的PY培养基中的单糖含量大致相当。
2.11. 开菲尔乳杆菌B6无细胞培养滤液对单核细胞增生李斯特菌的抑制
使用全自动微生物生长曲线分析仪 （Bioscreen C）进行提供单核细胞增生李斯特菌抑制补充信息的生长测定。含0.1% w/v GOS的PY肉汤（20 mL）用琼脂平板培养的开菲尔乳杆菌B6接种，37°C培养24小时。未改变的PY肉汤（10 mL）用琼脂平板培养的单核细胞增生李斯特菌接种，在相同条件下培养。然后将开菲尔乳杆菌培养物通过0.2 mm孔径注射器过滤器过滤到两个通用瓶中，约等体积。测量pH，并用0.1 M NaOH（aq）将其中一个瓶的pH调节至7.2。然后通过过滤（0.2 mm注射器过滤器）将两种上清液灭菌到无菌通用瓶中。Bioscreen微孔板上的孔用150 mL双倍强度PY肉汤制备（三个重复）。然后向每个重复添加120 mL未调节的开菲尔乳杆菌B6培养上清液（pH 4.2）、调节上清液（pH 7.2）或蒸馏水。所有三组然后用30 mL单核细胞增生李斯特菌培养物（用新鲜PY肉汤稀释至10%浓度的24小时培养物）接种，孔中总体积为300 mL，上清液浓度为40%。
将上述实验的微孔板装入全自动生长曲线分析仪，程序设置如下：培养温度37°C，持续时间24小时，每30分钟读数，波长600 nm，间歇摇动，按照制造商说明操作。运行完成后，将数据导出到Microsoft Excel进行处理。
2.12. 统计分析
每组实验进行三个重复，共培养实验除外，其中两个样品在两个实验运行中评估，总共四个重复样品。微生物计数在计算平均值和标准偏差之前转换为对数。使用ezANOVA版本0.98和Microsoft Office Excel 2007上的t检验评估微生物分析数据，以确定P < 0.05和P < 0.01显著性水平的差异。
3. 结果
3.1. 酸和胆汁耐受性
图1. 开菲尔乳杆菌B6在pH 3（A）和pH 2（-）下的酸耐受性；误差棒代表标准偏差。
开菲尔乳杆菌B6在体外分析其耐受酸（图1）和胆汁盐的能力。在酸耐受性实验中，开菲尔乳杆菌B6的活菌数在pH 3下120分钟内缓慢下降。活菌数首次显著（P < 0.05）低于0时间点的时刻是45分钟，到120分钟时，相对于起始接种物8.3 log cfu/mL，总活力损失为3.7 log cfu/mL。在pH 2下，在第一个测量点（15分钟）观察到相对于起始接种物8.3 log cfu/mL的3.7 log cfu/mL的显著活力下降。剩余105分钟的活力损失更为渐进，到120分钟时达到相对于起始接种物的6.3 log cfu/mL。pH 2和pH 3之间的计数差异在0之后的所有时间点均显著（P < 0.05）。开菲尔乳杆菌B6不受胆汁盐影响。在含和不含0.4%（w/v）胆汁盐的PBS中，活菌数在6小时内稳定在约6.4 log cfu/mL左右（数据未显示）。
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