讨论
碳水化合物的利用以及调节糖分解代谢的整体调控途径与许多重要病原体的持久存在和毒力密切相关，包括变形链球菌、化脓性链球菌和肺炎链球菌。口腔的微生物群落包含数百种细菌系统型，依赖于这些生物膜中有限营养物质的细菌之间存在激烈的种间竞争。口腔共生菌和口腔病原体之间的相互作用对于决定牙菌斑的“健康”或“致病”状态至关重要。虽然在大多数低G+C革兰氏阳性菌中，CcpA及其辅阻遏物HPr-Ser-P是CCR的主要效应物，但CcpA非依赖性CCR在变形链球菌中主导着多种分解代谢途径的调节，包括fruAB、levDEFG以及纤维二糖和乳糖操纵子。这些在变形链球菌中的观察结果提出了一个问题：这种病原体中CCR的进化是变形链球菌独有的，还是可能反映了以口腔组织为自然栖息地的生物体在CCR控制上的普遍分歧？从本研究来看，至少一种丰富的共生菌以与变形链球菌相似的方式调控两个同源的CCR敏感操纵子的表达，但在ManL和CcpA调节碳水化合物利用的作用方面存在一些显著差异（图4）。
本研究中构建的各种突变体的表征证明了fruA、levDEFG和manL的表观同源物在变形链球菌和戈登氏链球菌之间的功能和调控具有高度保守性。与变形链球菌中的发现相似，FruA是戈登氏链球菌利用果糖聚合物所必需的，而levDEFG操纵子主要负责果糖的内化。也与变形链球菌相似，EIIMan的底物似乎包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖，甚至果糖。重要的是，变形链球菌中表达fruA和levDEFG操纵子所必需的LevQRST系统在戈登氏链球菌中序列和功能都是保守的。具体来说，失活levR基因（编码该四组分信号转导系统的响应调节器）导致诱导底物对两个操纵子的完全激活丧失（数据未显示）。因此，这些模型基因及其调控元件的高度保守性使得能够可靠地对比两种生物之间的CCR调控途径。
许多研究支持CcpA在戈登氏链球菌的分解代谢物抑制和碳水化合物依赖性基因表达调节中的作用，并且已证明CcpA可以结合该生物体中的CRE序列来影响靶基因的转录变化。这些包括CCR敏感的精氨酸脱亚胺酶(AD)基因，它们在葡萄糖存在下被紧密抑制。CcpA的失活导致AD表达对葡萄糖敏感性的显著丧失，删除arcA基因5'端的CRE序列也是如此，支持经典的CcpA依赖性基因表达途径在戈登氏链球菌中是有功能的。戈登氏链球菌中CcpA介导的葡萄糖依赖性基因表达调节的其他例子包括淀粉酶结合蛋白A基因(abpA(41))。相比之下，虽然CcpA的缺失对变形链球菌的基因表达有全局性影响，但仅在非常特定的体外条件下证明了ccpA突变体中对基因CCR的微小影响。否则，没有证据表明在诱导和抑制底物组合存在下生长时，ccpA突变体中CCR得到缓解，无论是在基因表达水平还是通过评估突变菌株的二次生长。这一陈述也适用于变形链球菌的胍丁胺脱亚胺酶(AgD)途径。AgD系统在生化方面和表达调控上与戈登氏链球菌的AD途径高度相似，两者都需要底物诱导并且对CCR敏感。然而，与戈登氏链球菌中的AD基因不同，变形链球菌中CcpA的失活并未缓解AgD基因表达的CCR。
尽管我们能够创造出可以证明CcpA对fruA和levD表达产生影响的条件，但在戈登氏链球菌中这些基因启动子区域附近缺乏CRE序列意味着观察到的CcpA对这些操纵子的微小影响是间接的。相比之下，变形链球菌中fruA的表达可以通过CcpA结合fruA启动子附近的两个CRE来控制。本文提供的工作首次证明CcpA非依赖性CCR在口腔共生菌响应碳水化合物的基因调节中起主要作用。具体来说，删除manL对二次生长的影响最为深远，并导致在所有测试的碳水化合物中fruA和levD的高水平表达。值得注意的是，戈登氏链球菌中ccpA的失活导致fruA和levD操纵子的表达水平降低。我们的数据证明CcpA对抑制的影响可以在ManL缺陷型菌株中被消除，并且使用mRNA测量和基因融合证明CcpA抑制manL表达，表明CcpA对levD和fruA转录的影响几乎完全归因于CcpA在manL负向调节中的作用。ManL效应CCR的机制尚未明确确定，但现有证据表明，与调节蛋白的变构相互作用或涉及ManL以及可能的其他PTS组分的磷酸中继可能是ManL依赖性CCR的潜在机制。
本研究的另一个重要发现是，在ccpA突变体中观察到Ser46磷酸化HPr蛋白的量急剧增加。将manL突变引入ccpA突变体菌株逆转了这种效应，双突变体的Ser-46-HPr水平较低，但总体HPr蛋白水平（图3）高于野生型菌株。由于在ccpA突变体中fruA和levD基因的CCR增强，而在ccpA manL背景中被消除，这一发现提出了HPr-Ser-P也可能是戈登氏链球菌中这些模型基因的CcpA非依赖性CCR效应物的可能性，类似于我们最近在变形链球菌中的报道。我们提出ManL和HPr-Ser-P都参与戈登氏链球菌的CCR，因为单独删除manL并未引起HPr-Ser-P水平的任何变化（图3）。此时不能排除ManL通过调节HPr基因ptsH的表达和活性来影响CCR的可能性。然而，我们实验室先前报道，在变形链球菌的manL突变体中可以观察到ptsH和ptsI(EI)基因表达的altered expression。
本研究还揭示了变形链球菌和戈登氏链球菌之间CCR调节的另一个重要差异。在变形链球菌中，通过PTS渗透酶施加的CCR显示出明显的糖特异性，当存在各个渗透酶的同源或偏好碳水化合物时，对CCR的影响更大。例如，EIIABMan主要在葡萄糖和甘露糖存在时赋予CCR，这与其在葡萄糖和甘露糖摄取中的作用一致，而FruI和EIILev仅在其偏好底物果糖存在时有效施加CCR。因此，有人提出，未磷酸化的EII蛋白（当EII参与传入碳水化合物的磷酸转移时存在）通过变构相互作用调节转录激活因子LevR的活性，从而控制fruA和levDEFG的表达。在戈登氏链球菌中，ManL依赖的CCR似乎对生长碳水化合物的性质相对不敏感。例如，在葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖存在下，fruA和levD的表达在manL突变体背景中相似地升高（表3和4）。一个可能的解释是，这种观察源于戈登氏链球菌中EIIMan复合物比变形链球菌具有更广泛的底物特异性。特别是，PTS测定（图2）表明ManL可能参与葡萄糖、甘露糖和半乳糖的转运，并且在manL突变体中果糖-PTS活性略有增加，这可能是由于LevDEFG复合物表达升高所致。由于manL突变体在果糖上也生长较慢，因此ManL也可能内化果糖。相应地，在manL突变体生长于菊粉（必须水解成果糖才能被细菌利用）时，fruA和levD的表达增强。因此，戈登氏链球菌中CCR对特定糖源的相对独立性可能与ManL在戈登氏链球菌中比在变形链球菌中有效内化更多底物的能力有关。值得注意的是，在甘露糖上生长的manL突变体中fruA和levD基因的表达水平几乎与菊粉上相同，这可能是由甘露糖通过果糖/甘露糖特异性酶II LevDEFG复合物在manL突变体中转运所诱导的。不过需要强调的是，ManL的缺失也可能导致利用多种偏好糖的能力降低，这可能导致糖酵解中间体减少，进而导致HPr-Ser-P水平降低。虽然情况似乎并非如此（图3），但不能排除ManL缺陷的影响部分源于HPr的量或磷酸化状态的改变。
本研究揭示的口腔链球菌CCR复杂性的另一个维度是ManL影响其自身操纵子表达的能力。因此，编码EIIMan渗透酶的manL操纵子的抑制受CcpA和ManL共同控制。基于本文描述的实验以及我们对变形链球菌的研究，似乎当碳水化合物浓度相当高（3至5 mM）时，CcpA可能会抑制manL和其他基因。
在这种情况下，经典的CcpA模型将适用，即细胞监测碳水化合物通过糖酵解途径的流量，通过ATP依赖的HPr激酶调节HPr-Ser-P的量。在较低的碳水化合物浓度下，ManL可以响应其细胞外底物的可用性来调节其自身的产生以及其他渗透酶的水平，通过不过量生产转运蛋白来节省能量。这种双层调节系统（图4）可能是在口腔细菌中进化而来的，并且应该非常适应口腔细菌所面临的环境，即长时间依赖于从糖蛋白释放的低浓度多种碳水化合物，其间穿插着现代饮食中常见的高浓度偏好碳水化合物。我们提出，口腔共生菌戈登氏链球菌和口腔病原体变形链球菌在调节偏好碳水化合物分解代谢方式上的这些细微差异反映了一种生态位适应，这可能使共生菌在有利于牙齿健康的条件下具有竞争优势，而变形链球菌在促进致龋菌群和龋齿出现的条件下更有效地优化糖的利用。未来的研究将更详细地检验这一假设。
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