本研究旨在验证携带人类免疫缺陷病毒1型反式转录激活因子肽标签的蛋白质的高产量和可溶性表达，并进一步探索Tat标签增加表达的潜在机制。选择大肠杆菌超氧化物歧化酶蛋白进行分析，包括SodA、SodB和SodC。正如预期，Tat标签蛋白的产量和溶解度均高于无Tat标签的蛋白，总SOD酶活性也观察到类似结果。与表达无Tat标签蛋白的菌株相比，过表达Tat标签蛋白的细菌细胞表现出更强的抗百草枯活性，表现为SodA > SodC > SodB。与MG1655野生型菌株相比，ΔSodA突变株在百草枯处理后生长受到抑制；ΔSodB和ΔSodC突变株的生长也受到轻微抑制。编码Tat标签蛋白的基因的mRNA转录水平高于编码无Tat标签蛋白的基因。此外，Tat标签蛋白的α-螺旋和转角含量高于无Tat标签蛋白，但其β-折叠和无规卷曲含量较低。这些结果表明，将Tat核心肽作为一种重要的碱性膜转导肽整合到融合蛋白中，可以增加mRNA转录，并促进异源蛋白在大肠杆菌中的高产量和可溶性表达。
引言
随着生物技术和生物工程的快速发展，大肠杆菌因其遗传背景清晰、培养简便经济、生长快速以及能产生足够蛋白质产量等特点，已成为广泛使用的常规宿主来表达异源蛋白。然而，由于异源蛋白被细胞蛋白酶降解和/或形成由错误折叠蛋白质聚集体组成的包涵体，其应用仍然受到限制。为了解决这个问题，已经分析了几种方法，例如优化遗传密码、增加相应mRNA的转录、优化Shine-Dalgarno序列以及改变细菌生长状态。然而，迫切需要获得异源蛋白高产量和可溶性表达的额外有效策略。例如，Wu等人曾报道，HIV-1病毒编码的反式转录激活因子核心肽可以促进异源蛋白在大肠杆菌中的高产量和可溶性表达，并展示了该标签在生物学领域蛋白质相关药物开发中的重要应用。因此，开发用于异源蛋白高产量和可溶性表达的融合标签可能是一种新策略。
Tat蛋白是蛋白质转导结构域超家族的成员。根据病毒株的不同，Tat的总长度为86-101个氨基酸，包含五个结构域，包括N端激活结构域、富含半胱氨酸结构域、中心结构域、富含碱性氨基酸结构域和富含谷氨酰胺结构域。作为一种细胞穿透肽，Tat核心肽由HIV-1病毒基因组编码，富含碱性氨基酸。Tat的碱性结构域是已知最短的细胞穿透肽之一，可导致在细胞核内大量积累，并能够跨生物膜递送多种异源大分子而不损失其生物活性，例如增强型绿色荧光蛋白、p53、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27以及铜锌超氧化物歧化酶。Tat还展现出在大肠杆菌中提供异源蛋白高产量和可溶性表达的新能力。为了阐明这一过程的机制，本研究检测了大肠杆菌Sod超家族基因的表达，包括SodA、SodB和SodC。与我们的假设一致，我们发现Tat核心肽作为一种重要的碱性肽，也能促进异源蛋白SodA、SodB和SodC在大肠杆菌中的高产量和可溶性表达。正如预期，Tat标签蛋白的产量和溶解度高于无Tat标签的蛋白，总SOD活性的结果也显示出类似的模式。与表达无Tat标签蛋白的细菌相比，过表达Tat标签蛋白的细菌的抗百草枯活性显著增加。此外，Tat核心肽可以通过增加mRNA转录水平来促进异源蛋白在大肠杆菌中的高产量和可溶性表达。而且，Tat标签蛋白的α-螺旋和转角含量高于无Tat标签蛋白，而β-折叠和无规卷曲含量较低。本研究为促进生物技术和生物工程中异源蛋白的高产量和可溶性表达提供了参考。
材料与方法
原核表达载体的构建
原核表达载体pET28b和pET28b-TAT由本实验室构建。选择大肠杆菌超氧化物歧化酶超家族基因，包括sodA、sodB和sodC，并使用表1所示的引物，通过PCR从大肠杆菌BL21(DE3)菌株中扩增其互补DNA片段。PCR产物使用DNA提取试剂盒进行凝胶提取，然后用限制性内切酶BamHI和XhoI消化，随后亚克隆到pET28b-Tat和pET28b中进行直接测序，如表2所示。
表1 本研究中使用的引物
表1 本研究中使用的引物| 引物名称 | 引物序列 (5‘ → 3’) |
|---|---|
| 大肠杆菌 | |
| pU: BamHI-SodA | 5'-CGCGGATCCGATGAGCTATACCCTG-3' |
| pD: XhoI-SodA | 5'-CCGCTCGAGTTTTTTCGCCGCAA-3' |
| pU: BamHI-SodB | 5'-CGCGGATCCGATGTCATTCGAATT-3' |
| pD: XhoI-SodB | 5'-CCGCTCGAGTGCAGCGAGATTTT-3' |
| pU: BamHI-SodC | 5'-CGCGGATCCGATGAAACGTTTTAG-3' |
| pD: XhoI-SodC | 5'-CCGCTCGAGCTTAATTACACCAC-3' |
表2 本研究中使用的原核表达载体的特征
| 载体 | 异源蛋白的cDNA片段 | 融合蛋白编码区大小 (bp) | 待表达的融合蛋白 | 待表达的融合蛋白大小 (kD) |
|---|---|---|---|---|
| pET28b-Tat-SodA | BamHI-Tat-SodA-XhoI | 743 | Tat-SodA-6 × His | 27.23 |
| pET28b-SodA | BamHI-SodA-XhoI | 756 | 6 × His-SodA-6 × His | 27.69 |
| pET28b-Tat-SodB | BamHI-Tat-SodB-XhoI | 693 | Tat-SodB-6 × His | 25.42 |
| pET28b-SodB | BamHI-SodB-XhoI | 705 | 6 × His-SodB-6 × His | 25.87 |
| pET28b-Tat-SodC | BamHI-Tat-SodC-XhoI | 597 | Tat-SodC-6 × His | 21.83 |
| pET28b-SodC | BamHI-SodC-XhoI | 609 | 6 × His-SodC-6 × His | 22.29 |
表2 本研究中使用的原核表达载体的特征
表1 本研究中使用的引物| 引物名称 | 引物序列 (5‘ → 3’) |
|---|---|
| 大肠杆菌 | |
| pU: BamHI-SodA | 5'-CGCGGATCCGATGAGCTATACCCTG-3' |
| pD: XhoI-SodA | 5'-CCGCTCGAGTTTTTTCGCCGCAA-3' |
| pU: BamHI-SodB | 5'-CGCGGATCCGATGTCATTCGAATT-3' |
| pD: XhoI-SodB | 5'-CCGCTCGAGTGCAGCGAGATTTT-3' |
| pU: BamHI-SodC | 5'-CGCGGATCCGATGAAACGTTTTAG-3' |
| pD: XhoI-SodC | 5'-CCGCTCGAGCTTAATTACACCAC-3' |
表2 本研究中使用的原核表达载体的特征
| 载体 | 异源蛋白的cDNA片段 | 融合蛋白编码区大小 (bp) | 待表达的融合蛋白 | 待表达的融合蛋白大小 (kD) |
|---|---|---|---|---|
| pET28b-Tat-SodA | BamHI-Tat-SodA-XhoI | 743 | Tat-SodA-6 × His | 27.23 |
| pET28b-SodA | BamHI-SodA-XhoI | 756 | 6 × His-SodA-6 × His | 27.69 |
| pET28b-Tat-SodB | BamHI-Tat-SodB-XhoI | 693 | Tat-SodB-6 × His | 25.42 |
| pET28b-SodB | BamHI-SodB-XhoI | 705 | 6 × His-SodB-6 × His | 25.87 |
| pET28b-Tat-SodC | BamHI-Tat-SodC-XhoI | 597 | Tat-SodC-6 × His | 21.83 |
| pET28b-SodC | BamHI-SodC-XhoI | 609 | 6 × His-SodC-6 × His | 22.29 |
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