益生菌是指摄入足够量后，对人体健康产生益处的一类活的微生物的总称。乳杆菌属、双歧杆菌属，以及乳球菌、嗜热链球菌和酵母菌等作为目前益生菌产业中主要应用的微生物，其的安全性与稳定性问题不容忽视。
益生菌株的筛选标准极严格，大多数菌株通常来自于无致病菌历史、健康人群的胃肠道。菌株需具备在胃肠道中定植的能力，同时兼具较高的耐酸和耐胆盐能力。在此基础上，通过对菌株全基因组测序结果进行深度分析，并结合微生物学检测和毒理学评价等，对其所携带的耐药基因、致病性基因和环境抗性基因进行系统阐述。以人群试验和临床试验结果为重要评判指标，最终确定菌株是否具有安全性。然而，随着菌株的流通和广泛使用，菌株往往会出现衰退现象，具体表现为，原有形态变得不典型，发酵周期变长，发酵特性变差，抗不良环境减弱等生物学特性。因此，深入研究与评估益生菌的遗传稳定性具有重要意义。
鼠李糖乳杆菌Probio-M9是由内蒙古农业大学团队于2017年从健康妇女母乳样中分离得到的1株具有潜在益生特性的益生乳酸菌，其在胃肠液中具有较强的存活率，同时鼠李糖乳杆菌Probio-M9还可通过肠道-脑轴途径改善应激后成人的心理和生理生活质量以及通过调节肠道环境和改善炎症来抑制大肠肿瘤的形成等。本研究以鼠李糖乳杆菌Probio-M9为研究对象，从菌株形态变化、碳水化合物利用能力以及菌株代谢特性等多方面对其在连续传代培养（100代）过程中的稳定性进行系统评价，同时结合比较基因组学深入分析其遗传稳定性，找寻其进化的基本规律，确保其具备优良的遗传稳定性，为鼠李糖乳杆菌Probio-M9后续更深层次的研究提供理论基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌株来源
鼠李糖乳杆菌Probio-M9菌株由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库（LABCC）提供。
1.1.2设备与仪器
HWS28型电热恒温水浴锅，天津知署科技有限公司；立式低速离心机，德国Eppendorf公司；恒温培养箱，上海恒科技仪器有限公司；DG250厌氧工作站，英国DWS公司；EF20 pH计，瑞士梅特勒-托利多公司；UV-1100微量紫外分光光度计，NanoDrop公司；BX50光学显微镜，日本OLYMPUS公司；Applied biosystems PCR仪，伯乐公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司。
1.2试验方法
1.2.1鼠李糖乳杆菌Probio-M9连续传代培养方法
1.2.1.1绘制生长曲线
将鼠李糖乳杆菌Probio-M9原始菌种从-80℃保藏环境中取出，活化后接种到液体MRS培养基中（设置3组平行），接种量为1%。在37℃恒温条件下、厌氧培养24 h，每隔2 h取样，测定其在波长600 nm处的吸光值，确定菌株到达稳定期时间。
1.2.1.2菌株连续传代培养
将鼠李糖乳杆菌Probio-M9原始菌种从-80℃保藏环境中取出，活化2代后，在固体MRS培养基上进行划线操作，并将划线后平板于37℃恒温条件下培养72 h后，随机挑取3个单菌落，每个单菌落分别接种于液体MRS培养基中，37℃恒温条件下厌氧培养24 h，再接种到相应液体培养基中进行传代，接种量为1%，将第0，25，50，75，100代分别标记为A0、A25、A50、A75和A100。
1.2.1.3菌株培养代数计算
以1.2.1.1节确定的稳定期时间作为传代培养时间，将菌株以1%接种量接入新鲜液体培养基时的初始活菌数记为N0，稳定期时的活菌数记为Nf，通过公式log2100（Nf／N0）计算一个生长周期内的生长代数（也即细菌进行分裂的次数）。
1.2.1.4菌株连续传代培养过程细胞、菌落形态观察
鼠李糖乳杆菌Probio-M9连续培养100代过程中，对不同代时菌株进行革兰氏染色、镜检，观察细胞、菌落形态，初步检验菌株纯度，并保留A0、A25、A50、A75和A100代革兰氏染色镜检图片。
1.2.1.5菌株连续传代培养过程碳水化合物代谢能力检测
鼠李糖乳杆菌Probio-M9在连续培养100代过程中，采用梅里埃碳水化合物鉴定（API 50CH）试剂盒分析其利用49种碳水化物化合物（表1）的代谢能力，将A0、A25、A50、A75和A100代菌悬液吸取至BioMerieux API 50CHL碳水化合物鉴定试剂条中，并用无菌石蜡封口，37℃培养48 h后进行结果判定。培养液中所含溴甲粉紫指示剂变为黄色（25号管变为黑色）为阳性反应，表明该菌株可代谢对应的碳水化合物；不变色为阴性反应，表明该菌不可代谢对应碳水化合物。
表1 API 50CHL乳杆菌鉴定系统各种碳水化合物一览表
1.2.1.6菌株连续传代培养过程代谢产物检测
保留鼠李糖乳杆菌Probio-M9 A0、A25、A50、A75及A100代菌液的上清液，以苯乳酸（Phenyllactic acid）、柠檬酸（Citric acid）、酒石酸（Tartaric acid）、苹果酸（Malic acid）、琥珀酸（Succinic acid）、4-羟基苯乳酸（4-Hydroxyphenyllactic acid）、苯甲酸（Benzoic acid）、草酸（Oxalate）、水杨酸（Salicylic acid）、苯丙酸（Propionic acid）、乳酸（Lactic acid）、丙酸（Propionic acid）、丁酸（Butyrate）、己酸（Hexanoic acid）、乙酸（Acetic acid）物质为标品，进行靶向代谢物测定。
1.2.2鼠李糖乳杆菌Probio-M9连续传代过程比较基因组学研究
1.2.2.1基因组DNA提取及纯度检测
对鼠李糖乳杆菌Probio-M9第0，25，50，75，100代的DNA进行提取，提取到的DNA通过Nanodrop超微量分光光度计平台进行纯度测定，使用1.0%琼脂糖凝胶电泳对DNA完整度及纯度进行检测。使用经典STE法对菌株的全基因组进行提取，纯度检测同上，使用Qubit荧光定量仪进行浓度检测，满足要求后通过Nanopore三代测序平台进行全基因组的测序。
1.2.2.2组装及环化
通过NextDenovo软件完成3代数据的组装，进一步使用circlator软件将三代数据进行环化，采取CGview在线软件对环化结果可视化。通过pilon软件使用二代数据对三代数据进行polish。参照Perl脚本统计15株不同代时菌株基因组信息。
1.2.2.3平均核苷酸一致性（ANI）计算
15株不同代时菌株基因组与鼠李糖乳杆菌Probio-M9原始基因组进行ANI计算，借鉴Goris等报道的方法，用自制Perl脚本比较菌株之间的ANI值。TBtools软件进行ANI聚类热图绘制。
1.2.2.4单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）位点分析
DNA传代过程中，SNP位点常作为分子突变标记之一，单个碱基的插入或缺失导致的单个核苷酸发生突变从而导致DNA序列的改变。利用Soapsnp软件对三代序列进行SNP位点检测。Samtools软件对二代数据进行突变碱基识别。
1.2.2.5系统发育树构建
将1.2.2.4节中识别到的SNP
位点整理成序列，在软件iTol内将基于邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建的系统发育树进行可视化。
1.2.2.6共线性分析
本研究中将鼠李糖乳杆菌Probio-M9与5个不同代时的15株全基因组序列在Mauve（v2.3.1）软件内进行共线性分析。
1.3数据处理