CbpB是维持细胞包膜完整性所必需的
为探索CbpB破坏对羊布鲁氏菌的影响，使用电子显微镜监测突变体的细胞包膜。野生型在TSB培养基中显示布鲁氏菌细胞的天然球杆菌形态（图5a）。相比之下，CbpB的缺失导致细胞伸长和形态缺陷（图5b）。接下来，我们检测了ΔcbpB::km在1/3 TSB中的表型。ΔcbpB::km在细胞表面显示气泡状突起（图5d），这在野生型中不存在（图5c）。这些结果表明CbpB可能参与完整的细胞包膜。
图5. 野生型和突变体菌株在渗透压生长中的细胞形态。 16M (a)、ΔcbpB::km (b)和CcbpB (e)在TSB中的透射电子显微镜观察。野生型16M菌株(c)、突变体ΔcbpB::km菌株(d)和CcbpB (f)在1/3 TSB中生长8小时后的透射电子显微镜观察。测量了16M和ΔcbpB::km菌株的细胞尺寸(g)。每个测量约计数50个细胞。P<
ΔcbpB::km细胞显示最大长度为1.07 μm，平均长度（0.98±0.04 μm；n=50）长于野生型的平均长度（0.75±0.03 μm；n=50）（图5e），表明过度生长和缺乏细胞长度限制。当在1/3 TSB中生长时，ΔcbpB::km菌株也显示出明显伸长的细胞尺寸（1.17±0.15 μm，n=50），与野生型相比（0.67±0.07 μm，n=50；图5e）。
此外，使用实时定量PCR确定cbpB缺失对TSB中细胞壁合成相关基因、胁迫相关基因和细胞分裂基因转录的影响。结果显示cbpB突变体中minC、pbp-2、pbp-6B和pbp-6C的转录水平分别上调2倍、9倍、14倍和23倍（图6a-c）。我们发现与野生型在TSB培养基中相比，ΔcbpB::km突变体中aqpX的转录量增加了近5倍（图6c）。
图6. TSB中pbp基因、细胞分裂基因和胁迫相关基因表达水平的实时PCR分析。 (a) CbpB突变影响pbp基因的mRNA水平。(b) 细胞分裂基因和(c)胁迫相关基因。进行非配对t检验，ΔcbpB::km与野生型或互补菌株的ΔCT值之间获得统计学显著性（P值为0.05）。
讨论
在本研究中，我们构建了cbpB的标记缺失突变体，以鉴定该基因并评估其在布鲁氏菌中的作用。我们的研究证明CbpB对小鼠持续性感染很重要，cbpB突变体在细胞包膜完整性和洗涤剂抗性方面存在缺陷。此外，我们证明cbpB控制布鲁氏菌水通道蛋白和几种青霉素结合蛋白及细胞分裂蛋白的表达，表明cbpB似乎是布鲁氏菌的一个重要因子。
羊布鲁氏菌CbpB是一种环腺苷酸结合蛋白
环腺苷酸结合蛋白（CAP）已被预测存在于多种细菌物种中，如布鲁氏菌属、结核分枝杆菌、百脉根中慢生根瘤菌、大肠杆菌、黄色粘球菌和铜绿假单胞菌。黄色粘球菌拥有一种环腺苷酸结合蛋白CbpB，是一种405个氨基酸的蛋白，具有C端串联两个CAP结构域。铜绿假单胞菌PAO1的CbpA编码一种265个氨基酸的蛋白，具有一个C端CAP结构域。流产布鲁氏菌的BAB1_2005蛋白仅有一个C端CAP结构域。CbpB中参与环腺苷酸直接结合的氨基酸残基是高度保守的。我们将CbpB鉴定为羊布鲁氏菌中的一种环腺苷酸结合蛋白。
在最新研究中，百脉根中慢生根瘤菌的环腺苷酸结合蛋白MlotiK1（与CbpB有25%同一性）影响K+通道。由于布鲁氏菌CbpB仅含有一个CAP结构域，没有MlotiK1的"GYG"特征序列，其功能可能与MlotiK1不同。此外，在低K+培养基中，ΔcbpB::km的存活比例与野生型菌株相比没有显著差异。
cbpB突变影响细胞形态
在先前的研究中，已描述了一系列与胁迫耐受性相关的环腺苷酸结合蛋白，如黄色粘球菌的CbpB和结核分枝杆菌的Crp。除了对热和渗透压胁迫的敏感性外，16M ΔcbpB::km对洗涤剂（SDS）的敏感性也增加。
尽管布鲁氏菌cbpB基因与其上游基因otpR共享一个启动子（图1b），但实时PCR结果显示删除cbpB不影响otpR的表达。当引入pMRcbpB（含cbpB位点）时，ΔcbpB::km突变体在胁迫试验中成功恢复其亲本特征（图3和图4）。我们的数据清楚地证明CbpB在多种胁迫抗性中发挥重要作用。
与以前报道的任何CAP蛋白不同，删除cbpB表现出细胞肿胀和细胞伸长，在TSB中以及在1/3 TSB中细胞表面的囊泡形成（图5）。青霉素结合蛋白强烈影响细菌的大小、形状和分裂时间。新月柄杆菌的PBP-2调节细胞伸长和直径。此外，minC同源物，如百脉根中慢生根瘤菌保守minB操纵子的一部分和大肠杆菌MinC，分别是细胞分裂抑制剂，其缺失导致分支且比野生型对照更大。因此，我们假设PBP-2和/或MinC的过量产生会导致ΔcbpB::km菌株中的细胞伸长。我们的qRT-PCR数据表明ΔcbpB::km中pbp-2和minC的转录分别上调约9倍和2倍（图6）。这些结果证明CbpB参与青霉素结合蛋白的产生和细胞分裂过程。
水通道蛋白在细菌生理学中发挥重要作用，包括调节细胞形态和渗透压条件。已确认流产布鲁氏菌aqpX基因编码的水通道蛋白是一种高效的水通道。由于删除CbpB在低渗胁迫下产生细胞表面囊泡，我们假设这种现象可能是由水通道蛋白表达不当引起的。在我们的研究中，ΔcbpB::km中aqpX的转录在TSB中上调（图6c）。这些结果表明CbpB是维持aqpX水通道所必需的。
CbpB是羊布鲁氏菌在BALB/c小鼠中成功建立持续性感染所必需的
先前的研究表明，布鲁氏菌IV型分泌系统对于创建支持布鲁氏菌在宿主细胞内复制的内质网衍生细胞器以及在实验感染小鼠中的脾脏定植至关重要。BAB1_2005蛋白被鉴定为VirB底物。为评估cbpB在羊布鲁氏菌毒力中的作用，删除CbpB显著影响细菌在BALB/c小鼠中8-12周的复制，这些结果表明cbpB可能在干扰宿主免疫系统方面发挥重要作用。此外，有限的胁迫生长、洗涤剂抗性和/或细胞包膜完整性缺陷也可能影响羊布鲁氏菌在宿主体内的存活。
致谢
本研究得到国家重点基础研究发展计划（973计划）（2010CB530202）、国家自然科学基金（30871882和31372446）的资助。作者声明无利益冲突。