3. 结果
3.1 外部PASTA结构域对PknB功能很重要
先前已证明，在分枝杆菌中过表达具有酶活性的PknB会导致生长抑制和细菌形状改变。此外，外部PknB_PASTA结构域对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌PknB条件突变体的功能互补是不可或缺的。然而，PknB_PASTA结构域在调控分枝杆菌生长和肽聚糖生物合成中的精确作用仍不清楚。在我们的初始实验中，我们研究了过表达pknB的耻垢分枝杆菌的生长模式。
图1. 本研究中生成的PknB构建体和菌株的示意图。Kinase，N端激酶结构域（氨基酸1-279）；TM，跨膜区（氨基酸331-354）；TM-PASTA，青霉素和丝氨酸或苏氨酸激酶相关结构域（氨基酸331-627）；MYC-HIS，His标签；PASTA（氨基酸354-626）。
将全长pknB或其缺失编码外部PASTA结构域区域的截短形式（pknB-ΔPASTA）克隆到含有四环素调控启动子的pMind质粒中（图1）。将质粒转化到耻垢分枝杆菌中，所得菌株PknB1（pknB）、PknB5（pknB-ΔPASTA）和MIND（空质粒）在没有诱导剂四环素的情况下在所有测试培养基中生长相似。然而，向PknB1或PknB5菌株添加四环素会影响液体培养基中的生长（图2）。这种抑制效应可能是由pMind质粒中pknB和pknB-ΔPASTA的表达诱导引起的。在四环素存在下生长时，PknB1和PknB5以相对较高水平表达pMind中的pknB版本，对应于所有16S-rRNA转录本的1%（±0.3%），如定量RT-PCR所判断；在没有四环素的情况下，未检测到分枝杆菌中靶基因的表达。有趣的是，过表达pknB版本导致了不同的生长特征。在所有培养基中，PknB1菌株具有更长的表观迟滞期（达到可检测浊度的时间）和更慢的生长速率（图2），表明过表达缺失外部PASTA结构域的截短PknB比过表达全长激酶的毒性更小。
图2. pknB和pknB-ΔPASTA过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响。将早期静止期的分枝杆菌（5×10⁶）接种于含各种培养基的100孔蜂窝板中，在Bioscreen生长分析仪中于37°C振荡培养5天，存在四环素。呈现的数据是两个独立实验的五次重复的平均值。标准偏差为平均值的10%或更低，为清晰起见未显示。
为了直接进一步研究PknB_PASTA结构域在细菌生长中的作用，我们将编码结核分枝杆菌膜锚定外部结构域的pknB区域（指定为tmp，图1）克隆到pMind质粒中，并将该质粒转化到耻垢分枝杆菌中。在没有四环素的情况下，MIND和TMP菌株生长相似（图3a，实心符号），其通过q-RT-PCR分析的cDNA含有相似水平的tmp转录本。然而，添加四环素导致TMP菌株中tmp转录本的过表达（达到总16S rRNA转录本的9.6±0.8%），这导致生长抑制，特别是在Sauton培养基中（图3a，空心符号）。
图3. PknB_PASTA过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响。（a）耻垢分枝杆菌菌株在Sauton培养基中的比较生长动力学。使用相同的接种物（每孔约2×10⁶细胞）分别接种诱导（+四环素）和对照培养物。（b）非分泌型PASTA结构域或单独的跨膜结构域的过表达不影响分枝杆菌生长。（c）通过Western印迹检测耻垢分枝杆菌菌株膜组分中的PknB_TM-PASTA-6×HIS。（d）通过Western印迹检测耻垢分枝杆菌菌株细胞质组分中缺失跨膜区的PASTA结构域。
TMP菌株需要更长的时间来启动细菌生长，但其生长速率与MIND对照菌株观察到的相同。这种表型高度可重复，并且在体外传代后没有改变。没有跨膜结构域的PASTA结构域（PknB13）、单独的跨膜结构域（PknB9）或带有一个PASTA单元的跨膜结构域（PknB10；图1）的表达对细菌生长没有显著影响（图3b）。过表达带有两个或三个PASTA单元的PASTA结构域（分别为PknB11和PknB12）的菌株显示出轻微的生长缺陷。根据qRT-PCR，所有PASTA变体均以相似水平表达。我们生成了TMP的Myc-6xHis标记版本（指定为TMPH菌株）和可溶性PASTA结构域（指定为PknB14），并通过Western印迹研究它们的定位。TMPH在包膜组分中检测到，而PknB14在耻垢分枝杆菌的细胞质中发现（图3c，d）。重要的是，TMPH和TMP菌株在所有描述条件下生长没有差异。这些结果证实，只有含有四个PASTA单元的表面暴露结构域显著损害分枝杆菌生长。
PknB_PASTA结构域的过产生也影响了细胞形态。菌株的显微镜检查显示，不规则形状的细长TMP细胞积累（图4b，左图），类似于部分耗竭PknB的细胞，表明过表达的PASTA结构域可能干扰了PknB功能。此外，万古霉素-BODIPY标记揭示了TMP分枝杆菌中新生肽聚糖分布异常（图4b，中图）。在对照MIND细胞中，新合成的肽聚糖主要定位于极和中细胞（图4a），而TMP细胞在整个细胞表面显示弥散染色（图4b）。我们还观察到显著比例的未标记或弱标记TMP细胞（图4b）。TMP分枝杆菌倾向于聚集，表明细胞表面改变、细胞分离延迟或裂解增加。
图4. PknB_PASTA过表达导致细菌形态和万古霉素标记的改变。从对数生长期的分枝杆菌用万古霉素-BODIPY偶联物标记，洗涤后装片于PBS中，使用Diphot 300倒置显微镜检查。显示每个菌株的三个独立视野。标尺表示5 μm。（a）MIND和（b）TMP。左图，相差显微镜；中图，荧光显微镜；右图，合并图像。箭头指示标记的肽聚糖。
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