2、结果与分析
2.1噬菌体的分离与形态学观察
于2023年4月25日，从浙江省宁波市北仑区路林市场下水道采集的水样中分离纯化得到一株小肠结肠炎耶尔森氏菌的烈性噬菌体，并将其命名为Yersinia phage Yen-yong1，简称Yen-yong1(yong取自宁波的简称“甬”的拼音)。
Yen-yong1在指示菌株CICC 10869的菌苔上形成透明、边缘光滑且带有晕圈的圆形噬菌斑(图1A)。Yen-yong1可在1.5 h内将原本浑浊的CICC 10869培养液变为澄清透明的噬菌体-菌裂解液(图1B)，表明其对CICC 10869具有强烈的裂解活性。
▲图1 Yersinia phage Yen-yong1的噬菌斑、菌裂解液、解聚酶验证与电镜图。A：Yersinia phage Yen-yong1在小肠结肠炎耶尔森氏菌CICC 10869菌苔上形成的噬菌斑；B：小肠结肠炎耶尔森氏菌CICC 10869正常菌液(Control)与Yen-yong1裂解液(Test)；C：Yersinia phage Yen-yong1解聚酶验证结果；D-F：透射电子显微镜下的Yersinia phage Yen-yong1。
噬菌斑周围的半透明晕圈被认为是由噬菌体的解聚酶裂解宿主菌胞外聚合物所致。Yen-yong1的透明噬菌斑外围存在明显的半透明晕圈(图1A)。根据1.2节所述方法进行验证实验，结果表明Yen-yong1的基因组中可能含有解聚酶基因(图1C)。
透射电子显微镜观察结果显示，Yen-yong1呈现长尾病毒样(Siphovirus-like)形态特征(图1D-1F)。其头部呈椭圆形，长度为(83.32±0.15)nm，宽度为(59.57±2.28)nm；尾部长度为(168.04±3.21)nm，宽度为(9.17±0.60)nm。
2.2噬菌体的基因组分析
Yen-yong1的全基因组序列已提交至GenBank数据库，登录号为OR712444。其基因组平均测序深度为1 355.8×，长度为51 321 bp，G+C含量为47.80%，共包含93个ORFs(编号为NMDCX0002088)，且未发现固定末端。经tRNAscan-SE检索，Yen-yong1基因组中未发现编码tRNA的基因。
在Yen-yong1的93个ORFs中，有33个无法通过BLASTp注释(即no hit)。进一步使用在线注释工具HHpred和HMMER进行注释、验证和校准后，共有46个ORFs被注释为已知功能蛋白，占总数的49.46%。其中，13个ORFs的Top BLAST hit(即BLASTp中相似度最高的序列)与噬菌体基因相关，仅有7个ORFs的Top BLAST hit来自小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体基因，3个ORFs的Top BLAST hit来自大肠杆菌噬菌体基因(编号为NMDCX0002088)。这一结果提示肠杆菌科细菌噬菌体之间可能存在共进化和基因水平转移，也可能是因为小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体分离和测序较少，导致参考序列不足。此外，14个ORFs的Top BLAST hit来自小肠结肠炎耶尔森氏菌基因，5个ORFs的Top BLAST hit来自耶尔森氏菌属其他菌基因，表明该噬菌体与其宿主细菌之间可能存在基因交换。
Yen-yong1的基因组中未发现溶原相关基因。经VFDB和CARD检索，也未发现毒力因子和抗生素耐药基因，这从基因组水平上表明其应用的安全性。
ORF 13被注释为编码谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)。GST是一类广泛存在于真核生物和原核生物中的酶，也是谷胱甘肽结合反应的关键酶，催化谷胱甘肽结合反应的起始步骤。GST通过谷胱甘肽偶联发挥抗氧化和解毒功能，保护生物体。此前未见有关噬菌体携带GST基因的报道。
Yen-yong1基因组被注释的基因基于功能呈现有规律的模块化分布(图2)：5个ORFs被注释为编码溶菌相关蛋白(ORF 45、46、47、48、52)；3个ORFs被注释为编码参与噬菌体DNA包装的蛋白(ORF 71、72、73)；20个ORFs被注释为编码参与DNA复制、调控与代谢的蛋白(ORF 8、9、11、12、16、17、19、20、21、22、30、31、32、33、36、42、43、44、60、78)；1个ORF被注释为其他功能(ORF 13)；17个ORFs被注释为编码噬菌体结构蛋白(ORF 1、74、76、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93)。
▲图2 Yersinia phage Yen-yong1的基因组图谱
在噬菌体溶菌模块中，ORF 45和46被注释为编码穿孔素(holin)，ORF 47被注释为编码内溶素(endolysin)，ORF 48被注释为编码probable i-spanin subunit。在噬菌体裂解宿主的“三步模型”中，holin、endolysin和spanin分别完成由内到外破坏细菌宿主的细胞膜与细胞壁的各步。Holin是一种控制宿主裂解的必不可少的小分子膜蛋白，可在细胞膜上形成跨膜孔，使内溶素(即细菌溶解酶)能够进入细胞壁水解细菌的肽聚糖，而spanins可破坏宿主菌的外膜。在holin和endolysin完成内膜渗透与肽聚糖降解后，spanins破坏细菌外膜，使宿主细胞裂解以释放子代噬菌体。ORF 52编码的蛋白含有溶菌酶样结构域(lysozyme like domain)，可能是一种溶菌酶。
尽管2.1节所述噬菌斑与解聚酶验证试验结果显示Yen-yong1具有解聚酶活性，但本研究综合运用多种注释工具，仍未从Yen-yong1的基因组中发现明确的解聚酶基因。通常情况下，对于序列新颖的噬菌体，由于参考序列较少，其基因组中能被生物信息学工具注释的ORFs所占比例较低，大多不足60%。当前公共数据库中小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体的参考序列相对较少，相关研究报道也较少。本研究综合运用多种生物信息学注释工具，仍有50.54%的ORFs未能成功注释，暂时也未能准确注释出其解聚酶基因。
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