2.4 Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪测定MIC
取过夜培养的VRE菌液，按1:100体积比接种于3 mL BHI肉汤培养基中，37°C、180 rpm振荡培养8-10 h至对数生长期后期。以MHB肉汤培养基万倍稀释，使菌液浓度达到5×10⁵ CFU/mL。
打开Bioscreen C PRO全自动微生物生长曲线分析仪电源，预热30 min。检查传导液液位，确保位于箭头以上。按键"mode 21 enter"进行自检，确认光源、温度和培养板震动正常。自检完成后按"reset"键复位。
在超净台中，用1 mL移液枪分别吸取300 μL混合均匀的菌液至Bioscreen专用蜂窝板中。设置Bioscreen软件参数：培养温度37°C，培养总时长24 h，检测时间间隔30 min，振荡模式选择"medium"（10 Hz/s），检测波长选择600 nm宽波段滤光片以排除培养基颜色对OD值的干扰。
将含有不同浓度药物（枯草三十七肽终浓度梯度为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μg/mL；万古霉素终浓度梯度为5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10 μg/mL）及菌液的蜂窝板放入Bioscreen仪器中。以未接种菌液的MHB肉汤培养基作为空白对照。确认试验设置后开始检测，Bioscreen将全自动日夜工作，每30 min自动读取各孔OD值并记录。
培养结束后，导出Excel格式的OD值数据。以空白对照孔OD值为基准进行校正，绘制各浓度药物条件下VRE的生长曲线。通过Bioscreen软件分析各孔的生长曲线，确定抑制细菌生长的最低药物浓度即为MIC。Bioscreen能够精确捕捉细菌生长的延迟期、对数期和稳定期，通过比较不同药物浓度下的生长曲线形态变化，可更准确判定MIC值。
2.5 Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪进行棋盘法药敏试验
取对数生长期VRE菌液（OD值0.2-0.5），以MHB肉汤培养基万倍稀释至约1×10⁶ CFU/mL。将枯草三十七肽和万古霉素分别进行倍比稀释。
按照棋盘格方式将不同浓度的两种药物组合加入Bioscreen蜂窝板中，每个药物组合设置3个重复孔。同时设置仅含药物的阴性对照孔和仅含菌液的阳性对照孔。将蜂窝板放入Bioscreen C PRO全自动微生物生长曲线分析仪中。
设置Bioscreen参数：培养温度37°C，培养总时长24 h，检测时间间隔30 min，振荡模式"medium"，检测波长600 nm。启动检测程序，Bioscreen将自动记录各孔在不同药物组合条件下的生长曲线。
培养结束后，导出各孔完整的生长曲线数据。通过Bioscreen软件分析各药物组合条件下VRE的生长曲线特征，包括延迟期时长、最大生长速率、最大OD值等参数。根据生长曲线判定各组合的抑菌效果，按公式FIC = MIC(万古霉素联用)/MIC(万古霉素单用) + MIC(枯草三十七肽联用)/MIC(枯草三十七肽单用)计算部分抑菌浓度指数。判定标准：FIC<0.5为协同作用，0.5-1.0为相加作用，1.0-2.0为无关作用，>2.0为拮抗作用。
2.6 Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪进行时间-杀菌动力学试验
设置6个实验组：①万古霉素80 μg/mL；②枯草三十七肽30 μg/mL；③枯草三十七肽40 μg/mL；④万古霉素80 μg/mL + 枯草三十七肽30 μg/mL；⑤万古霉素80 μg/mL + 枯草三十七肽40 μg/mL；⑥空白对照组。
每组加入3 mL灭菌BHI培养基和相应药物，按1:100体积比接种调整后的菌液（终浓度5×10⁵ CFU/mL）。将各组样品分别加入Bioscreen蜂窝板中，每组设置3个重复孔。
将蜂窝板放入Bioscreen C PRO全自动微生物生长曲线分析仪中。设置参数：培养温度37°C，培养总时长24 h，检测时间间隔30 min，振荡模式"medium"，检测波长600 nm。启动检测程序，Bioscreen将每30 min自动读取各孔OD值，实时绘制时间-杀菌曲线。
培养结束后，导出各组完整的生长曲线数据。通过Bioscreen软件分析各组生长曲线的变化趋势，包括延迟期、对数生长期和稳定期的特征。与空白对照组比较，评估各药物组及联合用药组的抑菌动力学特征。Bioscreen的高精度OD值监测能够灵敏反映细菌数量的动态变化，从而精确评估药物的杀菌速率和持续效果。
2.7 荧光定量PCR检测耐药基因表达
设置3组：①空白对照；②万古霉素40 μg/mL；③万古霉素40 μg/mL + 枯草三十七肽20 μg/mL。37°C过夜培养12 h后，采用TRIzon总RNA提取试剂提取总RNA，使用酶标仪测定RNA浓度。以II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，去除基因组DNA后合成cDNA。采用SYBR荧光染料法进行荧光定量PCR，检测vanR、vanS、vanH、vanA、vanX、vanY、vanZ等基因表达水平，以16S rRNA为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法计算基因表达倍数变化。引物由郑州尚亚基因公司合成，部分序列参照文献设计。
3 结果
3.1 Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪测定枯草三十七肽与万古霉素对VRE的MIC
采用Bioscreen C PRO全自动微生物生长曲线分析仪进行微量肉汤稀释法MIC测定。Bioscreen每30 min自动读取各孔OD值，连续监测24 h，生成完整的生长曲线。结果显示，随着枯草三十七肽浓度的升高，VRE的生长曲线延迟期逐渐延长，最大生长速率逐渐降低。当枯草三十七肽浓度达到160 μg/mL时，Bioscreen监测到的OD值在24 h内无明显增长，表明该浓度可完全抑制VRE生长，因此判定枯草三十七肽对VRE的MIC为160 μg/mL。
同样，Bioscreen监测万古霉素对VRE的生长曲线显示，当万古霉素浓度达到320 μg/mL时，OD值在24 h内维持基线水平，表明万古霉素单用对VRE的MIC为320 μg/mL（表1）。Bioscreen的高精度自动监测避免了人工判读的主观误差，使MIC判定更加客观准确。
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