微生物学中“生长”的概念:在一定时间和条件下细胞数量的增加(微生物群体生长)。在微生物学中提到的“生长”,一般均指群体生长,这一点与研究大生物时有所不同。

细菌生长曲线是专指单细胞微生物的。它是将少量的单细胞微生物接种纯种到一定容积的液体培养基后,在适宜的条件下培养,定时取样测定细胞数量,以细胞增长数目的对数做纵坐标,以培养时间做横坐标,绘制一条如图所示的曲线,我们称这条曲线为细菌的生长曲线。

细菌的生长周期一般分为四个阶段:延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。

案例经过

在今年遇到这样一个生长曲线:

这是一个厌氧瓶中血培养18小时后的生长曲线,这个患者的需氧瓶和厌氧瓶同时报阳:红色,涂片均为革兰阴性杆菌。转种血平板和麦康凯平板,中等大小,圆形凸起光滑湿润的淡黄色菌落,氧化酶阴性,上第DL-96E板,鉴定和药敏一样为嗜麦芽窄食假单胞菌且鉴定率100%。

奇怪的是,平时看见的血培养生长曲线都不是这样的。到底是什么原因导致两个瓶子的生长曲线不一样?而且厌氧瓶有两个生长周期?难道厌氧瓶的第二个生长周期提示有另外一个细菌生长?

我们取适量厌氧瓶里的培养物进行厌氧和需氧培养(血平板、嗜血平板、麦康凯平板、真菌平板),依然还是单个细菌生长。后上DL-NE版鉴定,依然为嗜麦芽假单胞菌,可以断定第二个生长周期不是其它细菌所为。

那么嗜麦芽窄食假单胞菌为什么会有两个生长周期,而且只有厌氧瓶有,需氧瓶没有?

案例分析

众所周知,细菌细胞的生长有赖于营养物质的吸收、细胞物质的合成和能量的产生。下面我们来了解一下微生物生长的营养物质。

微生物的营养物质:碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子、水。为微生物生命活动提供最初能量来源的物质称为能源,可分为两类:光能和化学能。绝大多数微生物的能量来源是化学能,能提供化学能的化合物包括无机物和有机物。处于还原态的无机物,如NH3、NH4*、NO2、S、H2S、H2、Fe2+等,在氧化过程中释放能量。能够利用这些能量的微生物都是细菌和古菌,称为无机化能营养型生物,如亚硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌、铁细菌等。

为微生物提供能量的有机物主要是糖类,在生物氧化过程中为微生物提供能量。糖类也是微生物主要的碳源,对于异养型微生物而言,最适合作为碳源的是含C、H、O原子的有机碳,其中糖类是最被广泛利用的碳源,其次为醇类、有机酸和脂质。

在糖类中,单糖优于双糖和多糖,己糖优于戊糖,葡萄糖、果糖优于甘露糖和半乳糖,淀粉明显优于纤维素和几丁质等同多糖,同多糖明显优于琼脂和木质素等杂多糖。

虽然糖类物质通常是许多微生物最容易利用的碳源物质与能源物质,但是微生物对不同糖类物质的利用也有差别。例如,在葡萄糖和乳糖并存的培养基中,大肠杆菌优先利用葡萄糖(称为速效碳源),然后利用乳糖(称为迟效碳源),呈现二次生长现象[1]。

查阅了关于细菌二次生长的文献,发现:

1961年,法国科学家莫诺(J·L·Monod,1910-1976)与雅可布(F·Jacob)发表“蛋白质合成中的遗传调节机制”一文,提出操纵子学说,开创了基因调控的研究。莫诺与雅可布最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙的自动控制系统,这个自动控制系统负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。

乳糖可作为培养大肠杆菌的能源。大肠杆菌能产生半乳糖苷酶,能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,以便作进一步的代谢利用。编码半乳糖苷酶的基因(简称z)是一个结构基因(structural gene);在z的另一侧还有β-半乳糖苷渗逅酶基因y和β-半乳糖苷转乙酰酶基因a。这个结构基因与操纵基因共同组成操纵子。

操纵基因受一种叫作阻遏蛋白的蛋白质的调控,这种阻遏蛋白后称调节基因。当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时,乳糖会起诱导作用,它与阻遏蛋白结合,使之从操纵基因上脱落下来。这时,操纵基因开启,相邻的结构基因也表现活性,细菌就能分解并利用乳糖了,这样,乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的诱导物。

上述内容表明,大肠杆菌的乳糖操纵子是一个十分巧妙的自动控制系统:当培养基中含有充分的乳糖,同时不含葡萄糖时,细菌便会自动产生半乳糖苷酶来分解乳糖,以资利用。当培养基中不含乳糖时,细菌便自动关闭乳糖操纵子,以免浪费物质和能量。

60年代中期,在操纵子中还发现了另一个开关基因,称为启动基因(promoter)。启动基因位于操纵基因之前,二者紧密相邻。启动基因由环腺苷酸(cAMP)启动,而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这样,葡萄糖便通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因,使结构基因失活,停止合成半乳糖苷酶。

由此可知,结构基因同时受两个开关基因的调控——操纵基因与启动基因。只有当这两个开关都处于开启状态时,结构基因才能活化。当培养基中同时存在葡萄糖和乳糖时,葡萄糖通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因,并进而抑制结构基因,使细菌不产生半乳糖苷酶。这种情况下,细菌便会自动优先利用葡萄糖,因为葡萄糖果是比乳糖更好的能源。

从上可知道,当培养基中同时有葡萄糖和其它糖的时候优先利用葡萄糖,葡萄糖利用完了再利用其它可以利用的能源,就产生了细菌的第二次生长。

下图是我科目前使用的血培养瓶(需氧和厌氧瓶的成分,其中能源方面厌氧瓶多了果糖,两者均不含乳糖)。

果糖是一种最常见的单糖,极易溶于水,在许多食品中存在,和葡萄糖、半乳糖一起构成了血糖的三种主要成分。果糖中含有6个碳原子,是葡萄糖的同分异构体,它以游离的状态大量存在于水果的果浆和蜂蜜中,果糖还能与葡萄糖结合生成蔗糖。

据文献报道,嗜麦芽窄食假单胞菌产酸明显:可利用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖、水杨酸、乙酸盐和丙酸盐等24种物质,而果糖、异丁酸盐、顺乌头酸盐和正丙醇则仅为部分菌株利用。

由此可见,一些嗜麦芽假单胞菌的菌株是可以利用果糖做为碳源供能的,而且对果糖的利用优于甘露糖和半乳糖。

案例结论

厌氧瓶中的第二次生长现象应该是葡萄糖利用完了后,启动了果糖作为能源,促进了嗜麦芽假单胞菌的再次生长。

不过,是否这个再次生长也是由果糖的操纵子引起的,还需要进一步的文献和实验的佐证。由于我们的需氧瓶不含果糖,所以只有一个生长周期。

善于发现,追根求源,知其然,知其所以然,才能提高理论水平和业务技能,获得基础研究的最好材料,这也是我们微生物人的工作原则。如果遇到问题就放弃,不仅自己能力不能提高,对临床也提供不了最好的帮助。


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