D-木糖发酵能力的筛选
我们首先基于在酵母提取物蛋白胨D-木糖固体培养基上生长的能力对819个分离株进行预筛选，以减少需要评估发酵的菌株数量。所有在固体木糖培养基上显示出可检测生长的分离株都在液体培养基中进一步分析。为此，将菌株接种在1毫升酵母提取物蛋白胨D-木糖培养基中，初始OD600为1.0。大约24小时孵育后，观察到不同分离株的细胞密度范围从OD600约5到33。菌株GS1.11-26在不同重复生长测定中显示OD600在28到33之间。为了监测液体酵母提取物蛋白胨D-木糖中的生长与发酵性能之间的相关性，评估了OD600高于5的分离株在含有40克/升D-木糖的YP培养基中的发酵。我们观察到，大多数最佳D-木糖发酵菌株在这种生长评估实验中也表现良好。因此，大多数差的D-木糖发酵分离株可以通过使用24小时内生长至OD600为15的截止值来排除，因为所有良好的D-木糖发酵分离株都生长至OD600高于15。因此，在液体酵母提取物蛋白胨D-木糖培养基中生长24小时并选择生长至最低OD600为15的分离株被认为是快速初步筛选和淘汰差表现者的最佳方法。
图4 从四倍体菌株GS1.11-26/Fseg25获得的48个预选D-木糖利用分离株在含有40克/升D-木糖的YP培养基中的D-木糖发酵曲线。27个表现最佳的选定分离株以绿色显示，亲本菌株GS1.11-26以红色显示。在相同条件下的预选步骤中获得了类似的发酵曲线。
使用这种方法，预选了约168个在24小时内生长至OD600约15的分离株，并进一步在半厌氧条件下测试其D-木糖发酵性能。这在不同批次的实验中进行，最终产生了48个具有中等至快速D-木糖发酵能力的分离株。为了进行适当比较，在单一发酵实验批次中评估了48个预选分离株。最终选择了27个D-木糖发酵性能接近GS1.11-26的最佳分离株。流式细胞术分析显示，选定的27个分离株都具有与二倍体对照菌株相似的DNA含量。因此，所有分离株似乎都是二倍体菌株，尽管不能排除一个或多个染色体的非整倍性。
杂交分离株有氧生长速率和抑制剂耐受性的筛选
GS1.11-26直接工业应用的一个缺点是有氧生长速率慢，这是酵母繁殖过程中制备足够接种物以启动工业发酵过程的关键因素。因此，我们筛选了27个D-木糖发酵菌株在含有葡萄糖作为碳源的合成培养基中的生长速率。重组菌株HDY.GUF5（Ethanol Red背景）在整个工作中用作参考，因为GS1.11-26是从该菌株背景开发的。在27个分离株中，只有6个显示出与HDY.GUF5菌株一样高的生长速率。当这6个分离株在富含抑制剂的云杉水解物中评估时，只有两个分离株（命名为GSF335和GSF767）比HDY.GUF5菌株生长得更好。两个菌株都被发现是二倍体，具有MATα/α交配型。它们被选择用于进一步评估。
图5 27个最佳D-木糖发酵分离株与菌株HDY.GUF5的相对最大生长速率比较。在含有20克/升葡萄糖的200微升体积合成培养基中使用Bioscreen测定进行生长，初始OD600为0.1。误差棒代表三次实验平均值的标准偏差。计算每个菌株获得的最大生长速率相对于HDY.GUF5的值。
二倍体GS1.11-26与Ethanol Red单倍体分离株的回交
在平行方法中，具有高D-木糖发酵活性的MATα/α二倍体菌株GS1.11-26与Ethanol Red的分离株ER17杂交。ER17之前在许多分离株中被选中，因为它在发酵中具有更高的乙酸耐受性，甚至比其二倍体亲本菌株Ethanol Red更好。
GS1.11-26与ER17的杂交产生了三倍体菌株。三倍体菌株中的减数分裂分离通常在一个四分体中产生两个单倍体和两个二倍体后代。获得二倍体后代很重要，因为单倍体菌株由于较低的遗传稳定性和稳健性而对工业应用没有吸引力。三倍体菌株进行孢子形成并分离104个分离株。大多数四分体产生四个有活力的孢子。然后评估所有分离株的重要表型性状。
GS1.11-26/ER17杂交分离株在D-木糖培养基中生长的筛选
首先筛选从GS1.11-26/ER17分离的104个分离株在酵母提取物蛋白胨D-木糖培养基中生长作为预筛选步骤。观察到最终OD600值范围从约2到33，表明D-木糖生长涉及多个遗传因素。由于在D-木糖上的生长和发酵之前已显示出良好的相关性，选择了在D-木糖培养基中生长最好的21个分离株进行下一步评估。
图6 从三倍体菌株GS1.11-26/ER17获得的104个分离株在含有20克/升D-木糖作为碳源的1毫升YP培养基中生长的筛选。细胞以OD600值1.0接种。20小时后测量最终OD600。亲本菌株GS1.11-26用作参考。
GS1.11-26/ER17杂交分离株有氧生长速率的筛选
进一步测试了21个最佳D-木糖生长分离株在葡萄糖培养基中的生长速率。它们在3毫升酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基中预生长。16小时后产生远低于HDY.GUF5生物量的分离株被排除。剩余的7个分离株在含有20克/升葡萄糖的合成培养基中测试生长速率。在预筛选步骤中16小时后产生较低OD600值的两个分离株被纳入比较。
图7 从三倍体菌株GS1.11-26/ER17获得的最佳D-木糖生长分离株在葡萄糖培养基中有氧生长速率的筛选。在含有20克/升葡萄糖的200微升体积合成培养基中进行Bioscreen测定，初始OD600为0.1。误差棒代表三次实验平均值的标凅偏差。
在生长速率测定中，测试的9个菌株中有7个显示出比GS1.11-26快得多的生长速率。两个分离株GSE17和GSE102在预筛选步骤中产生较低的OD600值，也显示出比GS1.11-26慢的生长速率，证实了预生长测定的结果。然后选择7个以接近HDY.GUF5速率生长的分离株进行D-木糖培养基中的最终发酵实验。
最优D-木糖发酵和抑制剂耐受性杂交菌株的选择
为了首先选择最佳D-木糖发酵菌株，评估了7个在葡萄糖中快速生长的杂交菌株在50毫升YP培养基中（含有40克/升D-木糖作为唯一碳源）的发酵性能。原始进化菌株GS1.11-26用于比较。如图8所示，两个菌株GSE44和GSE16非常好地利用了D-木糖，几乎与GS1.11-26一样好。它们的D-木糖利用速率（从CO2产生速率估计）略慢于GS1.11-26。
图8 从七个表现最佳的分离株（从三倍体菌株GS1.11-26/ER17获得）中选择高效D-木糖发酵分离株。发酵在含有40克/升D-木糖的50毫升体积YP培养基中进行。发酵过程中通过重量损失估算CO2释放。误差棒代表两次实验平均值的标准偏差。
这两个菌株GSE44和GSE16被测试对乙酸和云杉水解物的耐受性。GSE16显示出与HDY.GUF5菌株相似的乙酸和云杉水解物抑制剂耐受性（在含有6克/升乙酸、pH 4.5或80%云杉水解物液体部分、pH 5的液体酵母提取物蛋白胨葡萄糖中生长）。另一方面，GSE44显示出降低的耐受性，特别是对乙酸，仅在含有高达4克/升乙酸时生长，在5克/升乙酸时不再生长。因此，选择二倍体菌株GSE16（MATa/α）进行进一步评估。
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