使用哈维氏弧菌JMH597（luxN::Tn5，cqsS::Cmr）作为报告菌株检测AI-2活性的存在。由于哈维氏弧菌BB 120（=BAA-1116）被重新分类为坎贝氏弧菌（Vibrio campbellii），其突变株JMH597和BB152应命名为坎贝氏弧菌。报告菌株在30°C、150 rpm下于自诱导物生物测定（AB）培养基中培养至600 nm处光密度为1，然后在新鲜AB培养基中稀释1:5000。在无菌96孔黑色微孔板（Corning）中，将10 μL无细胞培养上清液加入90 μL稀释的报告菌株JMH597中。哈维氏弧菌BB152（luxM::Tn5）的无细胞培养上清液（源自BB120的突变株，产生自诱导物AI-2但不产生自诱导物I）作为阳性对照；新鲜AB和MB培养基以及添加DMSP的MB培养基作为参照。每个检测板包含三重复实验孔、对照孔和培养基参照孔。96孔微孔板在30°C、150 rpm下培养，每45分钟用Enspire 2300发光仪以化学发光模式测量发光度，直至新鲜培养基的发光度降至最低（4.5小时后）。本检测中使用的培养基均未引起报告菌株哈维氏弧菌JMH597的光产生增加超过背景值。AI-2活性以相对于相应参照无菌培养基发光度的倍数诱导表示。
纯化菌株的细胞在MB培养基中培养，然后以5000 g离心5分钟收集于1.5 mL无菌离心管中。使用Hipure细菌DNA试剂盒（美基，中国）提取基因组DNA。使用通用细菌引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增近全长16S rRNA基因序列。PCR产物使用ABI 3730xl毛细管测序仪（美国应用生物系统公司）测序。将获得的序列与GenBank中可用的16S rRNA基因序列进行BLAST比对，以确定近似的系统发育亲缘关系。使用MEGA 6.0软件包中的邻接算法，在对数据进行多重比对后生成系统发育树。16S rRNA基因序列已存入GenBank。
结果与讨论
61株珊瑚黏液相关细菌中，有6株使用生物报告菌株根癌农杆菌KYC55显示出诱导活性，表现为颜色强度明显增加（图1）。其中5株为α-变形菌分离菌，分别属于诺氏菌属（Nautella，n=1）、根瘤菌属（Rhizobium，n=1）、鲁杰氏菌属（Ruegeria，n=1）和一个未知群（n=2）；第6株与溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）密切相关（n=1）（表1；图2）。它们分离自三种珊瑚：星珊瑚属、扁脑珊瑚和鹿角珊瑚属（表1）。产生AHL的α-变形菌SCSIO 13371和SCSIO 13328可能是潜在新种，分别与Palleronia soli和Palleronia marisminoris的序列相似性为95%和97%。
表1 珊瑚黏液相关细菌及Vibrio shilonii DSM 13774产生的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）与自诱导物-2（AI-2）
| 分离菌 | 宿主 | 最接近的系统发育近缘种 | 相似度% | AHL | AI-2 |
|---|---|---|---|---|---|
| α-变形菌 | |||||
| SCSIO 13371 | 星珊瑚属 | Alphaproteobacterium A14 | 98 | ||
| SCSIO 13328 | 扁脑珊瑚 | Alphaproteobacterium A35 | 98 | ||
| SCSIO 13290 | 星珊瑚属 | Nautella sp. BBD-FLK-1d | 100 | + | |
| SCSIO 13061 | 鹿角珊瑚属 | Rhizobium tarimense PL-41 | 99 | + | |
| SCSIO 13112 | 扁脑珊瑚 | Ruegeria sp. LMD | 99 | + | |
| γ-变形菌 | |||||
| SCSIO 16422 | 疣状杯形珊瑚 | Cobetia marina HNS035 | 99 | ||
| SCSIO 16432 | 疣状杯形珊瑚 | Cobetia marina HNS027 | 99 | + | |
| SCSIO 13073 | 鹿角珊瑚属 | Halomonas sp. GX18B9-2 | 100 | ||
| SCSIO 13134 | 扁脑珊瑚属 | Salinicola halophilus CG:4.1 | 99 | ||
| SCSIO 13056 | 鹿角珊瑚属 | Salinicola halophilus CG:4.1 | 99 | ||
| SCSIO 13100 | 扁脑珊瑚 | Vibrio alginolyticus NBRC 15630T | 100 | + | |
| SCSIO 13133 | 扁脑珊瑚属 | Vibrio sp. NJ3 | 100 | ||
| SCSIO 13108 | |||||
| DSM 13774 | 阿根廷角孔珊瑚 | Vibrio shilonii | + | + | |
| 放线菌 | |||||
| SCSIO 13021 | 星珊瑚属 | Rothia amarae R-36507 | 99 | + | |
| SCSIO 13017 | 扁脑珊瑚 | Rothia amarae R-36507 | 99 | + | |
图1 珊瑚黏液相关细菌无细胞培养上清液中的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）。AHL的生成通过根癌农杆菌KYC55（pJZ372；pJZ384；pJZ410）报告基因产生的蓝色色素带来判定。
与先前研究一致，AHL信号被发现由与海洋无脊椎动物或藻类相关的玫瑰杆菌属（Roseobacter）、鲁杰氏菌属、诺氏菌属和弧菌属产生。多种AHL已在固氮根瘤菌中发现。在本研究中，从鹿角珊瑚属中分离的根瘤菌属SCSIO 13061显示出最强的AHL活性（图1）。希洛氏弧菌DSM 13774菌株也表现出强活性（图1），这与之前的报道一致。另一株产生AHL的弧菌与溶藻弧菌密切相关，溶藻弧菌是多种海洋动物的机会性病原体，但其活性低于希洛氏弧菌DSM 13774（图1）。考虑到这些菌株可能产生多种AHL信号分子，且不同种类的AHL即使在相同浓度下颜色诱导也不同，因此很难根据生物测定结果得出不同菌株产生AHL浓度的结论。因此，应使用LC-MS/MS进一步研究产生的AHL类型及其浓度差异。